HPLC法測定余甘子不同提取部位中沒食子酸的含量

軒轅歡，魏 敏，田紅林，成 杰（.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部，烏魯木齊 830004；.新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 83000；3.武警新疆總隊醫(yī)院藥局，烏魯木齊 83009）

余甘子為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實[1]，二級干、一級寒[2]，味甘、酸、澀[3]，具有清熱利咽、安神補心、潤肺止咳、收斂止瀉、開胃進食等功效[4]，其中沒食子酸為其主要有效成分[5]。目前，對于余甘子不同制備部位分離純化的相關報道較少。為了加大余甘子藥材的資源利用程度，本試驗采用相關分離純化技術制備了余甘子不同提取部位，并分析各提取部位中沒食子酸的含量，以為余甘子的更深層次研究提供科學理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括二級管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；721s 型紫外分光光度計（上海精科儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BS124S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 試劑

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：11672-201304，純度＞98%）；大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；C18硅膠（濟南博納生物技術有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

試驗所用藥材，經新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學部田紅林副主任藥師鑒定為真品，具體來源見表1。

表1 余甘子來源Tab 1 Origin of P.emblica

2 方法與結果

2.1 余甘子不同提取部位的制備

取余甘子藥材適量，粉碎，精密稱取1 g，置于250 ml量瓶中，加70%甲醇150 ml，超聲（功率：70 W 頻率：40 kHz，下同）處理2 h，加70%甲醇定容，靜置2 h，濾過；濾液水浴60 ℃蒸干，加水溶解，用乙醚和乙酸乙酯先后萃取，萃取液過大孔樹脂層析柱進行層析，以水～乙醇梯度洗脫，只留40%乙醇洗脫液和70%乙醇洗脫液（出膏率較高）；大孔樹脂40%、70%分流液水浴蒸干，加水溶解，過C18層析柱層析，分別得水、50%、70%甲醇洗脫液，60 ℃蒸干，依次得70%甲醇提取物、大孔樹脂40%乙醇洗脫液、大孔樹脂70%乙醇洗脫液、C18水洗脫液、C1850%甲醇洗脫液、C1870%甲醇洗脫液的干燥粉末，出膏率分別為70.5%、55.6%、50.2%、7.1%、11.7%、15.9%。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下進樣測定，結果各成分理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，各成分基線分離良好，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.對照藥材；C.70%甲醇提取部位；D.大孔樹脂40%乙醇洗脫液；E.C18水洗脫液；F.大孔樹脂70%乙醇洗脫液；G.C1850%甲醇洗脫液；H.C1870%甲醇洗脫液；1.沒食子酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.reference crube herbs；C.methanol 70% extracts；D.macroporous resin 40% ethanol elutent；E.C18water elution；F.macroporous resin 70% ethanol eluent；G.C1850% methanol eluent；H.methanol C1870%eluent；1.gallic acid

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，置于25 ml 量瓶中，加水溶解并定容，制成質量濃度為0.425 0 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于250 ml量瓶中，加水150 ml，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水定容，搖勻，靜置，濾過；棄去初濾液50 ml，精密量取續(xù)濾液20 ml，置于100 ml棕色量瓶中，用水定容，搖勻，即得[1]。

2.2.4 不同提取部位供試品溶液的制備 分別精密稱取70%甲醇提取物、大孔樹脂40%乙醇洗脫液、大孔樹脂70%乙醇洗脫液、C18水洗脫液、C1850%甲醇洗脫液、C1870%甲醇洗脫液的干燥粉末（過2號篩）各10 mg，分別置于100 ml量瓶中，加水適量，放置過夜，超聲處理10 min，放涼后加水定容，即得。

2.2.5 線性范圍考察 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液1、2、3、4、5 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相定容，制成系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以沒食子酸質量濃度（x，mg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝20 210x+110.1（r＝0.999 9，n＝6）。結果表明，沒食子酸檢測質量濃度線性范圍為0.042 5～0.212 5 mg/ml。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，沒食子酸峰面積的RSD為1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20140601）適量，分別于放置0、2、4、6、8 h時進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸峰面積的RSD為2.4%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20140601）適量，按“2.1”項下方法制備不同提取部位，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸峰面積的RSD 為1.5%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已含量的樣品（批號：20140601）適量，共6 份，按“2.1”項下方法制備不同提取部位，分別加入適量對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 取3 批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of sample（n＝3）

3 討論

余甘子中富含大量水解類鞣質、沒食子酸及酚酸類化合物，本試驗以用甲醇作為溶劑，所得沒食子酸含量較高，并篩選了20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇的提取效果，最終選擇70%甲醇為提取溶劑。

筆者首次采用大孔樹脂方法應用于維吾爾藥材余甘子總鞣質提取液的分離純化，洗脫時，采用水-乙醇梯度洗脫，分別選取不同質量濃度乙醇（20%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%）進行了預試驗，測定出膏率，最終選擇了出膏率較高的40%乙醇和70%乙醇進行沒食子酸的含量測定。采用C18層析柱層析洗脫時，采用了水、甲醇30%、50%、70%、90%、100%）進行了洗脫，測定出膏率，選擇了出膏率較高的水、50%甲醇、70%甲醇進行沒食子酸的含量測定。

綜上所述，該方法操作簡便、重復性好，可用于余甘子不同制備部位中沒食子酸含量的測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：311

[2]茹克婭·胡加阿不都拉，帕提古力·雅克甫，希爾艾力·吐爾遜，等.余甘子的維吾爾醫(yī)應用及研究進展[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2011，17（12）：61.

[3]王飛，包永睿，孟憲生，等.不同產地余甘子酚酸類成分HPLC指紋圖譜研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（4）：31.

[4]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編：下[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：335.

[5]王吉文，房志堅，成金樂，等.HPLC法同時測定鐵包金不同藥用部位中蘆丁和槲皮素的含量[J].中國藥房，2014，25（43）：4 098.