重慶道地藥材獨活與全國其他產區獨活主要藥效成分含量對比研究Δ

胡太德，陳紹成，譚 君（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 40111；.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

獨活始載于《神農本草經》，列為上品，擅治下半身風濕痹證，中醫臨床常與羌活配對聯用。歷代本草對其植物來源諸說不一，因其產地不同，差異較大[1-2]。我國藥典收載的獨活正品為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubescensMaxim.的干燥根，具有祛風除濕、通痹止痛的功效，臨床多用于風寒濕痹、腰膝疼痛，少陰伏風頭痛的治療[3]。有研究報道，獨活具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板等作用[2，4-7]，其中抗腫瘤的主要成分為蛇床子素、補骨脂素、傘形花內脂和異歐前胡素等[6]。2010版《中國藥典》（一部）以蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯為其指標性成分對其進行定性定量控制[3]。

作為我國獨活主產區重慶，近年來大力調整農業產業結構，在市政府的支持下，巫溪縣和巫山縣政府把獨活作為當地主要經濟產業來發展，該地區以片區種植為主，正逐步向中藥材生產質量管理規范（GAP）規范化種植邁進。為配合政府部門加快推進區域內道地中藥獨活產業的發展，對當地獨活的質量作分析評價很有必要。

近年來，已有學者對獨活在不同生長環境和不同采收時期等因素下主要藥效活性成分的含量變化進行了研究，并結合指紋圖譜進行了分析[8-10]。然而，目前對于重慶市道地藥材獨活不同主產區（巫山縣和巫溪縣）與全國其他產區獨活主要藥效活性成分對比研究尚未見報道。本課題組連續3 年（2012－2014年）于不同月份收集重慶巫溪縣和巫山縣獨活各9 批，其他地區獨活7 批，采用高效液相色譜（HPLC）法，結合2010 年版《中國藥典》（一部）收載標準，測定其主要藥效活性成分蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯的含量，對比分析重慶巫山縣、巫溪縣主產區和國內其他產區間獨活中上述兩種成分含量差異，綜合評價分析重慶道地藥材獨活的質量，以為重慶產獨活的品質評價、種質資源保護和GAP 規范化種植提供技術參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括二級管陣列檢測器（美國Waters公司）；AE200 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

蛇床子素對照品（批號：06-2010）、二氫歐山芹當歸酸酯對照品（批號：06-2011）均購自上海中藥標準化研究中心，純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

本研究收集來自各地的獨活（見表1），樣品經重慶第二師范學院陳曉麟教授鑒定為真品，標本保存于重慶第二師范學院；樣品粉碎，過三號篩，抽真空貯藏，備用。

表1 獨活來源Tab 1 Origin of A.pubescens

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，20%→28%A；5～10 min，28%→36%A；10～13 min，36%→41%A；13～20 min，41%A；20～23 min，41%→75%A；23～30 min，75%→95%A；30～35 min，95%A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。在上述色譜條件下，理論板數均不低于5 000，分離度大于1.5，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯對照品各適量，加甲醇制成每1 ml 含蛇床子素75.40μg和二氫歐山芹當歸酸酯83.60μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.巫山縣獨活；C.巫溪縣獨活；D.甘肅省獨活Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.A.pubescens in Wushan county；C.A.pubescens in Wuxi county；D.A.pubescens in Ganshu province

2.3 線性關系考察

分別精密稱取蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯對照品7.54、8.36 mg，置于25 ml具塞瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成含蛇床子素0.301 6 mg/ml、二氫歐山芹當歸酸酯0.334 4 mg/ml 的混合對照品貯備液。分別精密吸取不同體積上述對照品貯備液，以甲醇倍比稀釋制成不同質量濃度的系列混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯回歸方程分別為y＝3.02×107x+11 030.78（r＝0.999 9）、y＝1.84×107x+12 150.96（r＝0.999 9）。結果表明，蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯檢測質量濃度線性范圍分別為0.015 1～0.301 6、0.016 7～0.334 4 mg/ml。

2.4 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯峰面積的RSD 分別為0.16%、0.57%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：WX-1）適量，分別于放置0、2、4、12、24、48 h時進樣測定，記錄峰面積。結果，蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯峰面積的RSD 分別為1.18%、1.23%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（編號：WX-1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯峰面積的RSD 分別為1.15 %、1.16%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已含量的樣品（編號：WX-1）適量，共6份，分別加入高、中、低質量的蛇床子素、二氫歐山芹當歸酸酯對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取不同產地獨活各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

本研究結果表明，該方法操作簡便、重復性好，可用于獨活中蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯含量的測定。重慶巫山縣和巫溪縣獨活中主要藥效活性成分（蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯）的含量均高于2010 版《中國藥典》（一部）規定標準（蛇床子素不得少于0.50%；二氫歐山芹當歸酸酯不得少于0.08%），初步認為重慶巫山縣和巫溪縣產區獨特的地理條件與優越的生態環境適于獨活的種植。

對比分析重慶巫山縣、巫溪縣和國內其他產區獨活中二者藥效成分含量發現，重慶巫山縣產區獨活中蛇床子素和二氫歐山芹當歸酸酯的含量明顯優于巫溪縣和國內其他產區；巫溪縣和國內其他產區中部分獨活有效成分含量未達到2010 版《中國藥典》（一部）標準，需要對其質量進行進一步控制。

本研究還發現，不同產地間獨活的化學成分存在一定差異性，這可能與不同產地間地理條件與生態環境差異較大有關，需對其作進一步研究。本研究為重慶道地藥材獨活的品質評價、種質資源保護和推動當地獨活GAP 種植規范化提供了一定科學參考依據。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of sample（n＝3）

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