注射劑中不溶性微粒的測定及其對微循環功能的影響

梁慧慧，陳昕怡，錢江輝，沙先誼（復旦大學藥學院藥劑教研室/智能化遞藥教育部及全軍重點實驗室，上海

201203）

近年來注射劑中不溶性微粒可能引發患者嚴重不良反應等問題越來越引起醫藥工作者關注，如不溶性微粒造成局部組織缺血、血栓、組織肉芽腫、嚴重肺功能障礙甚至死亡[1]。然而，目前國內外藥典對注射劑的不溶性微粒僅僅設定大于10μm和大于25 μm兩個質控點，而對于小于10 μm的粒徑，如2.5μm并未嚴格規定。目前，全球范圍內對空氣中不溶性微粒的人體危害越來越重視，國內許多一線城市已建立對空氣中粒徑為2.5μm的不溶性微粒的監測。因此，注射劑中缺乏控制的小粒徑不溶性微粒是否會產生臨床用藥不良反應，也已成為一個重要的研究課題。

本研究選擇祛痰藥鹽酸氨溴索注射劑（AHI）[2-3]為模型藥物，考察并比較4個不同生產廠家的鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的數量和分布；通過復制肢體缺血再灌注（LIR）大鼠小腸腸系膜微循環模型[4-5]，考察4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒在動物水平上對微循環功能的影響，旨在為進一步提高注射劑的內在質量與臨床用藥安全性提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

BH-2微循環顯微鏡（日本Olympus公司）；BI-2000圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）；HANGPING FA-2004電子天平（上海天平儀器廠）；MilliQ純水儀（美國Millipore公司）；臺式離心機（北京市六一儀器廠）；NICOMPTMCW788激光散射粒度儀（美國Nicomp公司）；X90-3潔凈工作臺（上海正值凈化科技有限公司，潔凈度：100級）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氨溴索對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100599-200502，純度：＞99.6%）；鹽酸氨溴索注射液[A廠（原研廠），國藥準字J20140032，批號：227060（A1）、227086（A2）、128149（A3），規格：15 mg∶2 ml；B廠，國藥準字H20041473，批號：20120202（B1）、20120204（B2）、20130132（B3），規格：15 mg∶2 ml]；注射用鹽酸氨溴索粉末[C廠，國藥準字H20031344，批 號：20130327G6（C1）、20130327G10（C2）、20130406T4（C3），規格：每支30 mg；D廠，國藥準字H20050243，批號：12100722（D1）、13022726（D2）、13031428（D3），規格：每支15 mg]；聚苯乙烯微球標準品（上海啟發生物科技有限公司，規格：0.5μm、2.5μm、25μm）；甲醇、乙腈（美國TEDIA公司，色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法

2.1 顯微鏡計數法測定不溶性微粒[6]

按照2010年版《中國藥典》（二部）不溶性微粒檢查法中顯微鏡計數法的規定操作，在潔凈工作臺內進行操作，分別測定A、B、C、D廠共12批鹽酸氨溴索注射劑的有效濾過面積上最長粒徑大于10 μm和大于25 μm的微粒數。其中，10 μm以上的微粒不得超過3 000粒/支，25 μm以上的微粒不得超過300粒/支。

2.2 光子相關光度（PCS）法測定不溶性微粒[7-9]

采用PCS法，用激光散射粒度儀測定A、B、C、D廠共12批鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的粒徑及分布。測定參數為He-Ne激光；測定角度：90°；溫度：23 ℃；黏度：0.933 cPa；折光系數：1.333；波長：632.8 nm。對于注射液，取1支，將其外壁洗凈，小心開啟，用2ml一次性注射器抽取藥液后立即注入檢測池中，測定其粒徑及分布；對于注射用粉末，先用滅菌注射用水溶解15 min后，再按照注射液的方法測定。

2.3 不溶性微粒對大鼠腸系膜微循環的影響

2.3.1 不溶性微粒混懸液的制備 取鹽酸氨溴索注射液1支，用0.2μm孔徑濾膜濾過，取濾膜上的殘留物用250μl生理鹽水重新混懸，即得；取注射用鹽酸氨溴索粉末1支，先用生理鹽水制備成7.5 mg/ml的溶液，再吸取2 ml用0.2μm孔徑濾膜濾過，取濾膜上的殘留物用250μl生理鹽水重新混懸，即得；取3種粒徑的聚苯乙烯微球標準品，用生理鹽水稀釋成50μg/ml的稀釋液，即得。

2.3.2 分組、給藥與取樣 取大鼠于術前12 h禁食，自由飲水，采用Rosenthal法復制大鼠LIR模型，用橡皮圈環繞結扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松解，恢復血流灌注2 h后尾iv單次給藥。實驗分為模型組與正常組，每組再分為8小組，每小組10只，各組分別尾iv給予生理鹽水、4個廠家的鹽酸氨溴索注射劑和粒徑為0.5、2.5、25 μm的聚苯乙烯微球，給藥量為250μl。正常大鼠依次記為CN、CA、CB、CC、CD、CE、CF、CG組，模型大鼠依次記為RN、RA、RB、RC、RD、RE、RF、RG組。給藥20 min后觀測腸系膜微循環各項指標。

2.3.3 腸系膜微循環指標的觀測 實驗結束時暴露大鼠距回盲部10 cm處的腸系膜，固定于盛有37 ℃生理鹽水的微循環灌流盒中，將微循環顯微鏡與圖像分析系統連接，觀察和記錄各組大鼠腸系膜微循環變化，測定微靜脈血流速度（Blood flow velocity of venule，BFVV）、微靜脈管徑（Diameter of venule，DV）。①BFVV的測定：采用光點同步掃描法測定BFVV，調節光點使之與血管平行并順血流方向連續掃描，調節掃描速度使之與血流速度同步并記錄；②DV的測量：取血管較直段，與血管縱軸垂直方向測血管直徑3次，取平均值。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 不溶性微粒的顯微鏡計數法測定結果

4個廠家的鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的數量均符合《中國藥典》要求，并且廠家間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。顯微鏡計數法測定4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結果見表1。

3.2 不溶性微粒的PCS法測定結果

4個廠家的鹽酸氨溴索注射劑在0.5～50 μm的粒子掃描范圍內，其不溶性微粒的平均粒徑和《中國藥典》規定的兩個質控粒徑差別無統計學意義（P＞0.05），但其小粒徑（0.5～2.5 μm）的不溶性微粒數量差異具有統計學意義（P＜0.05）。其中，鹽酸氨溴索注射液的小粒徑不溶性微粒數量明顯少于注射用鹽酸氨溴索粉末復溶15 min后的小粒徑不溶性微粒數量。PCS法測定4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結果見表2，粒徑分布見圖1。

表1 顯微鏡計數法測定4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結果Tab 1 Results of insoluble particles of AHI from 4 manufacturers testing by microscope counting method

表2 PCS法測定4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒結果Tab 2 Results of insoluble particles of AHI from 4 manufacturers testing by PCS

3.3 大鼠的腸系膜微循環情況

在正常狀態下，與CN組比較，除CG組外其余各組大鼠BFVV明顯減小，CB、CD、CE、CF組大鼠DV明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.01），其中CE、CF、CG組微循環效果與粒徑大小呈負相關。LIR條件下，與RN組比較，其余各組大鼠BFVV明顯減小，RB、RD組大鼠DV明顯減小，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這表明在正常狀態條件下，CA、CB、CC、CD組大鼠的腸系膜微血管均出現了一定程度的微循環障礙，其中CA組大鼠的微循環狀態受影響程度最低，類似于CN組；CE、CF、CG組大鼠的腸系膜受到的微循環影響與粒徑呈負相關，即粒徑越小影響越嚴重。而在LIR狀態下，RN組大鼠的腸系膜微血管表現出流速減慢的特征，表明成功復制了LIR模型；RA、RB、RC、RD組大鼠的腸系膜微循環均出現明顯的一定程度的微循環障礙。正常狀態下和LIR狀態下各組大鼠的BFVV、DV比較分別見表3、表4。

4 討論

圖1 4廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒的粒徑分布圖Fig 1 Distribution of particle size of AHI from 4 manufacturers

表3 正常狀態下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 3 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in normal condition（，n＝10）

表3 正常狀態下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 3 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in normal condition（，n＝10）

注：與CN組比較，＊P＜0.01Note：vs.CN group，＊P＜0.01

本文采用PCS法考察了注射劑中不溶性微粒的粒徑及分布。相比于顯微鏡計數法，PCS法更能直觀地分析產品中不溶性微粒的分布。4個廠家的注射劑產品采用PCS法檢測不溶性微粒的結果表明，不溶性微粒數量均符合《中國藥典》規定；在0.5～50 μm的粒子掃描范圍內，其不溶性微粒的平均粒徑和《中國藥典》規定的兩個質控粒徑差異無統計學意義（P＞0.05），但小粒徑的不溶性微粒數量差異具有統計學意義（P＜0.05）。其中，原研A廠制劑中的不溶性微粒在此范圍內的不溶性微粒數量相對少于其余3個廠家的產品。在考察的制劑中，鹽酸氨溴索注射液的小粒徑不溶性微粒數量明顯少于注射用粉末，分析原因可能是：（1）注射用粉末由于需要加入一定量的甘露醇作為凍干保護劑，可能會引入不溶性微粒；另一方面，由于凍干粉末的溶解具有時間依賴性，未溶解的固體粉末可能也是導致在本研究的復溶時間條件下測定得的小粒徑不溶性微粒偏多的重要原因，如延長凍干粉末的復溶時間，可能在一定程度上會降低注射用粉末中小粒徑不溶性微粒的數量。（2）注射用粉末中膠塞在復溶過程中也可能導致一定程度的不溶性微粒的產生。（3）制備工藝的差異。

表4 LIR狀態下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in LIR condition（，n＝10）

表4 LIR狀態下各組大鼠的BFVV、DV比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of BFVV and DV of rats among groups in LIR condition（，n＝10）

注：與RN組比較，＊P＜0.01Note：vs.RN group，＊P＜0.01

為了進一步評價制劑的內在質量，本文通過建立微循環的動物模型，考察了4個廠家鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒對微循環功能影響的差異性。研究發現，4個廠家的鹽酸氨溴索注射劑組大鼠均出現了一定程度的微循環障礙，且影響微循環的程度具有明顯的差異性。其中，原研A廠制劑中不溶微粒的數量相對較少，對微循環的影響程度也相對較輕。對于已有微循環損傷的機體（即LIR狀態），注射劑中的不溶性微粒對其有更大的損傷。在陽性對照組中，0.5、2.5μm的不溶性微粒在正常狀態下對微循環的影響反而高于25μm的不溶性微粒，這可能主要是由于25μm的不溶性微粒經靜脈給藥后大部分微粒被肺循環濾過后，減少了不溶性微粒在觀察部位腸系膜微血管的蓄積，從而在一定程度上降低了不溶性微粒對微循環功能的影響，而小粒徑微粒反而更易在微血管部位蓄積。已有文獻報道，0.5μm左右的不溶性微粒與心血管系統疾病具有相關性[10]，而注射劑中小粒徑不溶性微粒數量的差異性是否會引起臨床用藥過程中患者的不良反應發生的差異性，以及是否具有劑量依賴性，則需要開展進一步的臨床評價研究予以確證。

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