體內藥物分析的HPLC柱切換平臺搭建與研究進展

盛陽昊，王 萍，劉丹琦，顏曉敏，周伯庭#（1.中南大學湘雅醫院藥學部，長沙 410008；2.中南大學藥學院，長沙 410013；3.株洲市愷德醫院藥學部，湖南株洲 412000）

20世紀70年代，Huber JFK等[1]開發了柱切換（Columnswitching）技術。首先在一級色譜柱完成被測組分與復雜基質的初分離，并通過閥切換來改變流動相的流向和組成，使目標組分從一級柱流向二級柱，并在二級柱上進行被測組分的測定，從而完成復雜樣品的分析。隨著近幾十年的發展，柱切換技術在21世紀初已基本完善，被廣泛應用于分析化學的各個領域，如環境分析、食品檢驗、體內藥物分析、制劑分析等。其中，在臨床藥物分析和藥動學中的應用最為廣泛，因為通過柱切換技術可實現復雜生物基質經簡單處理即可進樣或直接進樣，自動化操作減少了前處理過程中出錯的可能，提高了整個分析過程的準確性，縮短了時間，使復雜生物基質中小分子藥物分析變得簡便快捷。雖然柱切換技術已基本成熟，但是還沒有相應的商品上市，這需要依靠實驗室的搭建，因此柱切換技術在我國醫院藥學部門的應用并不普及，國內關于日常治療藥物檢測和藥動學的相關文獻報道也不多。柱切換高效液相色譜（HPLC）平臺搭建的關鍵是如何構建切換閥與色譜柱構成的色譜網絡，并根據醫院的具體情況選用合適的傳輸技術。為此，筆者以“Column switching”“柱切換”等為關鍵詞，檢索Elsevier、Springer、中國知網等數據庫，通過文獻分析臨床藥物柱切換平臺搭建的現狀與研究進展，同時總結應用不同的傳輸技術和色譜柱來構建色譜網絡的方法，為醫院藥學部門搭建HPLC柱切換平臺、簡化復雜樣品的處理過程提供參考。

1 HPLC柱切換平臺的儀器組成和搭建

HPLC柱切換平臺主要由進樣閥、切換閥、高壓泵、色譜柱、檢測器和控制、處理系統構成，可由普通HPLC加上若干切換閥和色譜柱等部件構成。下面具體分析色譜網絡的搭建過程。

1.1 一級色譜柱的選擇

復雜生物基質如血漿、血清等，其富含蛋白質，且被測藥物濃度往往較低，經過蛋白沉淀、液液萃取、離線的固相萃取后，一般需要揮干濃縮、復溶等一系列樣品前處理步驟。這些步驟不但耗時，而且存在操作復雜、精確性差等缺點。而柱切換平臺的第一級柱將直接實現生物基質中的大分子與待測組分的分離，富集和凈化待測組分。一級色譜柱的選擇主要根據去蛋白的形式和藥物性質來決定。

1.1.1 離線去蛋白 離線去蛋白一般采用強酸或有機溶劑，將渦旋離心后的上清液直接大體積進樣。一級柱一般選用小粒徑（5、10 μm）反相ODS或C8填料，可防止大體積進樣的峰展寬，柱子長短皆可；且由于去蛋白后的樣品較干凈，可有效延長一級柱的壽命。

1.1.2 在線去蛋白 使用在線去蛋白，一般選用兩種類型的柱子。第一類是粒徑較大（20～50 μm）鍵合鏈烴的柱子（也叫貫流色譜柱，Turbulent flow chromatography column），比如C18、C8、C2，也可鍵合其他類型的基團，如氰基[2]、氨基[3]。通過以水為主的一級流動相的洗脫，大分子蛋白質和一些親水物質被洗脫，被測組分被吸附而留在柱子中。此類柱子的優點是粒徑大，可使用高流速分析，縮短分析時間。但需注意的是，柱壓會隨著進樣次數的增多而顯著升高，粒徑越小越明顯，這時一級柱的再生清洗和流動相的選擇就非常重要。郭平等[4]用0.2 mol/L的乙酸作為清洗液，采用25～40 μm的大粒徑一級柱，進樣次數可達到800次以上，這可能與乙酸具有溶解蛋白并阻止在一級柱上沉積的作用有關。劉皋林等[5]發現，先用含有不同比例的水的甲醇溶液沖洗分析柱，后用純甲醇沖洗，可避免柱內的磷酸鹽析出或使柱內殘余的血漿蛋白凝固粘聚于柱內，由此延長柱的使用壽命。

第二類是20世紀80年代末發展起來的RAM（Restricted access media）柱，又稱為通道限制性填料柱。其分離的機制為分子排阻兼反相分離；當生物樣品通過限制性填料時，親水層對蛋白質無吸附作用，蛋白質被先洗脫；而疏水層對藥物等小分子物質有保留作用，再通過選擇適當的流動相，將小分子物質洗脫下來，從而實現組分的分離。RAM填料有不同的種類，在臨床藥物分析中應用較多的是內表面反相填料、烷基二醇硅膠和混合功能填料。張曉惠等[6]用內表面反相填料考察對鹽酸貝那普利的在線富集性能，發現RAM柱對鹽酸貝那普利具有良好的富集作用，能夠有效提高HPLC的靈敏度。Yu Z等[7]、樊鵬程等[8]均用Lichrospher ADS作為一級柱，在分析過程中，柱切換系統預柱及分析柱柱壓始終未發生較大增加，系統穩定性良好。郭志強等[9]通過自制裝填的混合功能RAM柱作為一級柱，以柱切換系統實現了對血漿樣品中替米沙坦的直接進樣含量測定。Friedrich G等[10]用Biotrap柱實現了血漿和尿中雙氫麥角隱亭的含量測定，結果回收率達99%，且精密度良好，線性范圍為25～1 000 pg/ml。

1.2 傳輸技術及色譜網絡構建

在臨床治療藥物濃度監測和藥動學分析中，絕大部分藥物只有1～2種相應的物質需要檢測，可選擇中心切割技術（Heart-cut）和反沖傳遞技術（Back-flush）來實現快速、準確的分離。其中，中心切割技術包含直接傳輸和間接傳輸兩種形式，而反沖傳遞技術包含反向傳輸形式。由于醫院臨床送檢樣品通量大，應用在線去蛋白時，可在基本傳輸技術的基礎上使用反沖清洗技術及時清洗一級柱，延長其使用壽命。

1.2.1 直接/間接傳輸 直接傳輸（見圖1）較多用于離線去蛋白。當六通閥處于OFF狀態（見圖1A）時，通過高壓泵將樣品泵入一級柱，用一級流動相（預處理流動）完成初次分離和富集樣品；同時，二級柱用二級流動相（分析流動相）完成最后分離。當直接進樣傳輸中切換閥處于ON狀態（見圖1B）時，通過一級流動相將富集的或初分離的組分送至二級柱；在二級柱用二級流動相分離的時候，一級柱可完成柱子的再平衡并再次進樣。

圖1 直接傳輸

間接傳輸在線去蛋白（見圖2B）和離線蛋白（見圖2A）都可應用。間接傳輸流路變換和具體過程與直接傳遞基本一致；與直接傳遞不同的是，從一級柱到二級柱，用的是不同流動相來洗脫被測物。

1.2.2 反向傳輸形式 反相傳輸見圖3。當六通閥處于OFF狀態（見圖3A）時，通過高壓泵將樣品泵入一級柱，一級流動相（預處理流動）將內源性基質洗脫，待測組分保留在柱端；同時，二級柱用二級流動相（分析流動相）完成最后分離。當切換閥處于ON狀態（見圖3B）時，通過二級流動相將富集在柱端的組分送至二級柱，同直接/間接傳輸不同的是，兩次流動相經過一級柱中的流向相反。此種反向傳輸，組分保留在一級柱端，可有效減少峰展寬。

圖2 間接傳輸

圖3 反向傳輸

1.2.3 反沖清洗技術 反沖清洗見圖4。當六通閥處于OFF狀態（見圖4A）時，樣品通過色譜柱進入后面的檢測器或色譜柱。當六通閥處于ON狀態（見圖4B）時，清洗流動相反沖柱子，起到凈化柱子的作用，在復雜生物基質直接進樣清洗一級柱中應用較多。Huber JF等[11]在反向傳輸形式的基本骨架上構建了應用反沖清洗技術的色譜網絡，并用梯度洗脫來沖洗一級分析預柱，延長了5 μm小粒徑一級柱的使用壽命。

圖4 反沖清洗

1.3 檢測器的選擇

從成本和醫院開展的日常治療藥物血藥濃度監測項目來考慮，紫外檢測器和熒光檢測器可滿足大部分藥物的線性范圍檢測要求，并可保持長期穩定，但對藥動學中一些濃度很低的代謝物分析卻無能為力。質譜檢測靈敏度高、分析速度快、選擇性高，而且經過柱切換分離的組分，成分純度相對較高、基質效應較小，但缺點是檢測器購置費和日常維護費較高。

1.4 色譜網絡構建分析與討論

醫院藥學部門的藥物分析柱切換平臺搭建與一般科研院所實驗室有所不同，必須根據醫院藥學部門的實際情況，重點考察耐久度、經濟性、時間復雜度3個重要評估要素來構建柱切換平臺。下面結合前文“1.1”“1.2”項中給出的兩種去蛋白形式和兩種傳遞技術來討論色譜網絡的構建策略。

在線去蛋白因為直接、簡便、準確，減少了人為干預程度，逐漸成為復雜生物基質中小分子測定技術發展的趨勢；與其相適應的一級柱為大粒徑反向柱（20～50 μm）和RAM柱。采用大粒徑反向柱，因粒徑較大，一般選擇反沖模式，被測物強保留在柱端，可有效控制峰展寬。但也有少數文獻采用中心切割模式[5，12]，但從文獻中的色譜圖可看出峰展寬控制明顯不佳，導致積分誤差增大、準確性降低。RAM柱相對于大粒徑柱則無此問題[6，13]。可根據被測物在一級柱上的保留情況，選擇具體的傳遞技術。

雖然在線去蛋白與反沖傳遞技術被大部分HPLC柱切換文獻所采用[14-15]，但此種組合的缺點是反沖使柱頭上的物質沖入分析柱，造成二級柱壓力升高，降低柱耐用性；同時反沖模式去雜質能力較中心切割模式差，容易將強保留物質沖入分析柱，也會增加二級柱的分離難度以及增加二級柱的負載，減少柱使用壽命。此外，不管是RAM柱還是大粒徑一級柱，隨著直接進樣次數增加，雜質堵塞色譜柱，會導致壓力升高，色譜柱耐久性差，需經常更換。所以，結合耐久度、經濟性來評估，此種組合并不適合臨床大通量的日常檢測；如果臨床樣品量較少，則可優先考慮此種組合。

離線去蛋白后進樣，樣品相對干凈，一級柱為小粒徑反向柱（5、10 μm），峰展寬控制較好，搭配上中心切割模式，二級柱負載小，壽命大大延長，可獲得極好的耐久性，經濟性同時也得到提高，更適合于臨床大通量藥物分析。

時間復雜度（指單次分析時間，時間長即復雜度高）也是進行大通量臨床藥物分析時一個重要的考慮因素。大粒徑的反向柱粒徑大，可使用高流速來載樣萃取，使時間復雜度有效降低。如Ynddal L等[16]測定美沙芬及其代謝物時，使用大粒徑一級柱，流速可達5 ml/min，載樣及清洗只需0.5 min。在不同的傳輸形式中使用雙泵的另外一個意義是進樣“雙工”，即在分析的同時使一級柱進行清洗并完成下一次進樣，這樣可減少時間復雜度，但這種“雙工”需要手動實現，不適合醫院藥學部門的大通量日常檢測。要實現在自動進樣器的基礎上全自動“雙工”，必須在基本色譜骨架上并聯修改。Ong VS等[17]比較了一根普通小粒徑反向一級柱與兩根大粒徑反向一級柱并聯組成的進樣“雙工”系統的分析速度，發現后者速度比前者快1倍左右，一次分析僅為2 min，耗費時間大幅縮短。Cass RT等[18]在反向傳輸形式的基本色譜骨架上，加上額外的一根二級柱和一個用于二級柱的平衡泵，實現了分析“雙工”：在一根二級柱分析的同時，另一根二級柱完成平衡，被測藥物的一次分析循環時間為3.3 min。如果醫院藥學部門每天檢測樣品較少，可采取單泵雙柱的直接傳輸來構建色譜網絡，這種模式比上述的雙泵雙柱的直接傳輸減少了一個泵，減少了系統復雜度，提高了經濟性，但同樣的會增加單次進樣循環的時間。高申等[19]用單泵雙柱、直接傳輸形式來構造色譜網絡測定苯妥英和卡馬西平，不需要專門控制設備，靈活、經濟，相對于其他傳輸形式系統的復雜性較低，利于推廣應用。

2 柱切換存在的問題

2.1 峰展寬

峰展寬在液相中由進樣量、柱外效應和被測物在柱子中展寬引起。在柱切換HPLC中，管路長度比普通HPLC大大增加，柱外效應也隨之提高。另外，在一級柱中，被測組分峰已經發生展寬；再加上被測組分需從一級柱中洗脫到二級柱中，相當于二級柱進樣體積超載，從而引起了峰展寬問題，降低了靈敏度和分離度。Schill G等[20]提出了柱切換系統峰展寬體積公式：

其中，Ve為從一級柱到二級柱的有效注入體積，Vi為在一級柱上洗脫到二級柱上的被測組分體積，Ks為被測組分用一級流動相在二級柱的保留因子，Vi又可寫成：

其中，x為被測組分在一級柱中的移行距離與柱子長度的比值，V0為一級柱死體積，Kp為被測組分用二級流動相在一級柱上的保留因子。將式（2）代入式（1），其中Ks遠遠大于1，可得：

從式（3）峰展寬表達式中可以看出，盡可能地減少分子中的x與Kp、增大分母中的Ks，即可達到減少峰展寬的目的。據此可加強二級流動相的強度，并適當加大兩種流動相的強度差，或使用反向傳輸形式，使被測組分保留在柱端，大大減少x，從而減少峰展寬。Yu Z等[8]通過采用上述優化法則，選用高強度的二級流動相與較低強度的一級流動相，并用反向傳輸形式，使得Vi≤2 000 μl、lgKs＞3、Ve＜2 μl，可以看出取得了較好的效果。但值得注意的是，Schill G等[20]提出的峰展寬公式只考慮到進樣量和在被測物在柱子中展寬兩個因素，并沒有涉及到柱外效應，可以通過在組裝時盡量減小管路長度來進一步減少柱切換HPLC的死體積。另外，可選擇更有效率的二級柱[21]，以獲得更好的分離度和柱效。

2.2 系統峰

系統峰是柱切換系統中一個常見的問題，指的是在不進樣情況下，切換閥空切換后，大體積一級流動相進入二級柱，破壞二級柱平衡，使色譜圖上有一些正峰或負峰存在，這些峰很可能干擾測定。Arvidsson T[22]指出，可調節一級流動相的pH，使其盡量與二級流動相的pH一致，也可改變一級流動相所含的鹽，加入與二級流動相相同的鹽類來避免系統峰。葉利民等[23]提出，當系統峰對被測組分有干擾時，可考慮通過以下方法加以避免：（1）改變流動相的組成及配比，使系統峰與被測組分峰分離；（2）在流動相中盡量減少鹽和其他添加劑的加入；（3）對于某些被測組分，對檢測限要求不高時，可選擇用較長波長測定；（4）在某些色譜條件下，有些系統峰的保留時間很長，可在被測樣品組分流出后，利用一級泵進行梯度洗脫，使高保留值的系統峰快速出峰，防止對下次分析造成干擾。

3 結語

綜上所述，柱切換技術可實現對體內藥物的直接分析，簡化前處理過程，并使整個過程更加快速、出錯的可能性減少、分離能力提高。臨床上可用于藥動學和體內藥物分析工作，監測血藥濃度，指導臨床用藥。隨著今后不同填料的研究以及更加巧妙的色譜網絡的提出，必將出現更多的組合模式，使其在臨床藥物分析中的應用更加廣泛。

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