白首烏C21甾苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

惠 勇，徐 雷

(1.牡丹江市第二人民醫(yī)院循環(huán)內(nèi)二科，黑龍江牡丹江 157011;2.牡丹江市第一人民醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江 157011)

缺血性心臟病發(fā)病率逐漸升高，心臟長期缺血導(dǎo)致心肌收縮功能出現(xiàn)障礙引起心力衰竭(CH)，是致使人體殘疾或死亡的首要病因［1］。雖然盡早恢復(fù)缺血心肌的血供，可能減少心肌不可逆的損傷，但是再灌注后可導(dǎo)致缺血的心肌損傷更為嚴(yán)重［2］。因此，如何有效地減輕心肌缺血再灌注(I/R)損傷儼然成為治療缺血性心臟病的最大挑戰(zhàn)。現(xiàn)代化學(xué)研究表明，白首烏中含有磷脂類、C21體酯苷、黃酮類化合物、多糖類及微量元素等多種成分，具有明顯的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老等多種藥理作用。白首烏C21甾苷能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基，是白首烏中的主要活性成分［3］，但是白首烏C21甾苷對心肌I/R 損傷的影響鮮見報道。本研究旨在觀察白首烏C21甾苷對心肌I/R 損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar 系雄性大鼠40 只，體重200～250g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。實驗動物合格證號為:P00102008、實驗動物使用許可證號:SYXK (黑)2008-033。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲食，12h 光照周期。實驗操作遵守中國動物實用指南。

1.2 白首烏C21甾苷的提取

白首烏粗粉用95% 乙醇回流提取，減壓回收溶劑得萃取物。萃取物稀釋后上大孔樹脂(D101)層析，水和95 %乙醇洗脫、收集95% 乙醇部分洗脫液;選擇薄層色譜法進(jìn)行定性分析;選擇紫外分光光度法測定C21甾體總苷的含量［4］。經(jīng)分析，C21甾苷的可測成分含量達(dá)65 %左右(按孕甾烯醇酮計)。

1.3 大鼠在體心肌缺血再灌注模型制備

手術(shù)之前禁食12h，可自由飲水，稱重后，腹腔注射100mg/kg 氯胺酮和5mg/kg 甲苯噻嗪，麻醉5～10min 后固定于實驗臺，氣管插管接呼吸機行機械通氣(呼吸頻率70 次/min，潮氣量6～7 mL/次)，分離右側(cè)頸動脈，經(jīng)頸動脈行左心室置管，記錄大鼠左心功能變化，選用標(biāo)準(zhǔn)II 導(dǎo)聯(lián)連接心電圖，計算機軟件記錄波形。經(jīng)左前胸第3、4 肋間開胸，打開心包，擠出大部分心臟，暴露心臟及左心耳，以5/0 線在距LAD 根部1～2 mm 系1 個袢，其間穿過1 根塑料管，拉緊袢，觀察心電圖變化，ST 抬高為結(jié)扎成功，結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗。25min 后拔出塑料管，使冠狀動脈血流再通40min，再灌時局部組織充血。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn):ST 段回落，心尖復(fù)紅［5-6］。

1.4 分組與處理

馴化1w 后隨機分為4 組:假手術(shù)組:大鼠麻醉后，打開胸腔，LAD 下穿線但不結(jié)扎;缺血再灌注組:手術(shù)結(jié)扎LAD 缺血25min，再灌注40 min;去勢組:大鼠手術(shù)去勢后恢復(fù)4w，然后再手術(shù)結(jié)扎LAD缺血25min，再灌注40 min;白首烏C21甾苷治療組:結(jié)扎LAD 手術(shù)前1w 胃給予白首烏C21甾苷1.0 g/ kg，連續(xù)7d，然后進(jìn)行手術(shù)結(jié)扎LAD 缺血25min，再灌注40 min。對照組，缺血再關(guān)注組和去勢組分別灌胃等體積的蒸餾水。

1.5 心肌組織TNF-α 和IL-6 含量檢測

離體心臟組織冰鹽水沖洗以去除任何紅細(xì)胞或血塊，勻漿緩沖液洗滌1 次，加4 倍體積勻漿緩沖液，冰上勻漿，4℃，2 500r/min 離心20min，取上清，然后根據(jù)ELISA 試劑盒說明書對TNF-α、IL-6 進(jìn)行檢測。

1.6 cTnT 的測定

實驗結(jié)束時，心臟取血約2mL，EDTA (22mg/mL)抗凝，3 000r/min 離心15min，取上清，然后根據(jù)cTnT ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.7 心肌組織病理學(xué)分析

心肌組織用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數(shù)字顯微鏡掃描。評分制評價組織細(xì)胞損傷程度:0 分(沒有損傷);1 分(輕度損傷)，間質(zhì)水腫和局灶性壞死;2 分(中度損傷)，彌散性心肌細(xì)胞溶脹和壞死;3 分(嚴(yán)重?fù)p傷)，細(xì)胞融合性壞死并伴隨中性粒細(xì)胞浸潤;4 分(極嚴(yán)重?fù)p傷)，廣泛的細(xì)胞融合性壞死，中性粒細(xì)胞浸潤及出血［7］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 心肌組織TNF-α、IL-6 含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組心肌組織TNF-α，IL-6 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與缺血再灌注組比較，去勢組和白首烏C21甾苷治療組心肌組織TNF-α、IL-6 含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是去勢組和白首烏C21甾苷治療組之間沒有顯著性差異(附表)。

2.2 cTnT 含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組cTnT 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與缺血再灌注組比較，去勢組和白首烏C21甾苷治療組cTnT 含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是去勢組和白首烏C21甾苷治療組之間沒有顯著性差異。(附表)。

附表 心肌組織TNF-α、IL-6 含量和cTnT 含量測定結(jié)果

2.3 心肌組織病理學(xué)分析結(jié)果

假手術(shù)組(0 分):未見明顯異常，顯示心肌正常結(jié)構(gòu);缺血再灌注組(4 分):明顯的心肌損傷，可見心肌廣泛融合性病變，心肌細(xì)胞斷裂、水腫，并且有中性粒細(xì)胞浸潤;去勢組和白首烏C21甾苷治療組(1分):僅見細(xì)胞有輕度水腫，未見片狀壞，肌纖維排列較為整齊(附圖)。

附圖 小鼠心肌組織組織病理學(xué)切片(40 ×)

3 討論

在心肌缺血再灌注過程中，雖然再灌注可以改善心肌的血液供應(yīng)，但也會加重心肌缺血所造成的損傷，導(dǎo)致血流動力學(xué)障礙、心功能異常、心肌細(xì)胞壞死和凋亡，嚴(yán)重危害患者的生命［8］，因此，對抗缺血及心肌I/R 損傷所引起的心肌梗死及功能障礙才是治療缺血性心臟病的根本目的。炎癥反應(yīng)在心肌I/R 損傷中發(fā)揮了重要作用，因此，抑制炎癥反應(yīng)在防治心肌I/R 損傷中具有重要意義［9］。近年來，大量研究表明，炎癥反應(yīng)參與了心肌I/R 損傷的形成。冠狀動脈再通后，中性粒細(xì)胞能夠釋放IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)等炎癥因子，這些炎癥因子相互影響、相互作用，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加、中性粒細(xì)胞的黏附，通過血管壁等活動，進(jìn)而導(dǎo)致心肌的損傷或心肌細(xì)胞的凋亡等［10］。TNF-α 是一種重要的炎性細(xì)胞因子，在正常的心肌組織中含量很低，但是當(dāng)急性心肌I/R 后于數(shù)分鐘由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞大量釋放。過量的TNF-α 致心臟的損傷，同時促進(jìn)IL-6 的釋放增加［11］。另外，鄒吉麗等［6］研究表明，心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6 主要由缺血及再灌注誘導(dǎo)。cTnT 作為心肌細(xì)胞所特有的一種調(diào)鈣蛋白，具有高度的心肌特異性，健康人的血清中cTnT 含量很低。雖然cTnT 在血中半衰期較短，僅2h，但由于其在細(xì)胞內(nèi)分布且含量豐富，并由壞死的結(jié)構(gòu)蛋白不斷釋放，使其在血中異常時間可持續(xù)6d 甚至數(shù)周，其被美國和歐洲心臟協(xié)會一致評價為確診急性心肌梗死的高特異性和高敏感性的血清學(xué)標(biāo)志物，其血清水平升高提示心肌細(xì)胞壞死［12-13］。

本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組TNF-α 和IL-6 含量明顯升高，由此可見，心肌缺血再灌注加重了心肌的損傷;與缺血再灌注組比較，白首烏C21甾苷治療組可明顯降低TNF-α 和IL-6 含量;本研究還發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組cTnT 含量明顯升高，由此可見，心肌I/R 損傷可引起心肌組織的梗死。與缺血再灌注組比較，白首烏C21甾苷治療組可明顯降低cTnT 含量，縮小梗死面積。同時組織病理學(xué)也發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組表現(xiàn)出明顯的心肌損傷，可見明顯的心肌損傷，可見心肌廣泛融合性病變，心肌細(xì)胞斷裂、水腫，并且有中性粒細(xì)胞浸潤，白首烏C21甾苷治療組僅顯示輕度損傷。

綜上所述，白首烏C21甾苷可顯著抑制心肌炎癥因子，減輕心肌組織形態(tài)損傷，縮小梗死面積，改善受損的心肌功能，從而起到保護(hù)心肌的作用，具體作用機制有待于進(jìn)一步研究。睪酮在心肌損傷過程中的作用可能是非常重要的，如睪酮對心肌細(xì)胞的損傷主要是通過促炎因子的釋放增加可促進(jìn)心臟功能障礙和重構(gòu)［14-15］。本研究所設(shè)置的去勢組的結(jié)果與白首烏C21甾苷治療組結(jié)果相同，所以白首烏C21甾苷是否拮抗雄激素的作用也是本研究進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

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