量子點制備和表征及標記黃曲霉毒素B1性能分析

韓 雍，汪 慧，宋 曦，李 響

(1 隴東學院農林科技學院，甘肅慶陽 745000;2南京中醫藥大學第二臨床醫學院，南京 210023)

以金納米顆粒、量子點、核殼型熒光納米顆粒為代表的納米粒子在生物芯片、免疫檢測分析、基因突變檢測、遺傳病和腫瘤診斷、藥物研究、食品及環境中強致病性病原菌的檢測是食品安全檢測技術發展的重要方向［1-3］。食品的中的殘留真菌毒素引發的食物中毒是食品安全最為重要的隱患之一，其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)最為嚴重，AFB1濃度較低的糧食和食品無法進行控制，傳統的薄層層析TLC 和液相色譜法LC，由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求;微生物法前處理較為繁瑣，耗時較長;免疫學方法所用的抗體具有不穩定的特性;PCR 計數法對設備和技術要求高等。實現快速、高靈敏、低成本、實用性強的AFB1檢測技術具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 大米，市售。

1.1.2 儀器與試劑 儀器:JEM2100 透射電鏡(TEM)、RF5301 熒光分光光度計、Biorad 電泳儀、WH-3 微型漩渦混合儀、HYG-Ⅱa 回轉式恒溫調速搖瓶柜、TGL-16C 離心機、DF-101S 型集熱式磁力加速攪拌器、PYX-DH5-50 隔水式電熱恒溫培養箱等。試劑:AFB1、羧基甲氧基拉明半鹽酸(CMO)、1-乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、牛血清白蛋白(BSA)、甲醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、3-乙酰基吡啶、磷酸鹽緩沖液，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 碲化鎘量子點的制備與表征 參照文獻［4］的方法加以改進，具體步驟為:①碲氫化鈉的合成:在50mL 圓底燒瓶內首先加入0.031 9g 碲粉(0.025mmol)、緊接著加入5mL 超純水、然后加入0.038 0g 硼氫化鈉(1.2mmol)，充氮氣保護，在室溫條件進行攪拌反應，溶液變成淡紫色結束反應。②巰基丙酸-碲配合物的形成:在250mL 三口圓底燒瓶中首先加入200mL 超純水、然后添加0.114 2g 水合氯化鎘(0.5mmol)和0.109 2g巰基丙酸 (1.2mmol)，并用NaOH 容易調節pH 至11.2，充氮氣維持約30min。③碲化鎘納米晶的制備:將步驟②制備所得溶液添加在巰基丙酸-鎘溶液中，充氮保護，在120℃進行回流反應約7h，將反應物進行透射電鏡掃描和熒光分光光度計對其形狀進行表征。

1.2.2 量子點與IgG 的結合與表征 試驗通過試劑EDC 和NHS 將羊抗兔IgG 連接到碲化鎘量子點表面［5］，參照文獻［6］方法，優化進行，具體操作為:①取400μL 的CdTe 量子點溶液，與40μL 含有2mgEDC 的PBS (0.01mol/L，pH 7.4)，在室溫下混合5min，再在搖床中反應15～20min。②接著加入0.5mgNHS 混合15min。③最后加入800μL 的IgG (400μL 2mg/mL IgG和400μL PBS 的混合液)，在搖床中混合2h。在4℃下，5 000r/min，離心15min，以除去未反應的IgG，吸出上清液，用PBS 清洗1 次后，再離心，沉淀加2mL 超純水溶解，將最終產品保存在4℃。

采用SDS-聚丙烯胺凝膠電泳［7］對CdTe 量子點與羊抗兔IgG 的結合物進行表征。電泳凝膠采用12%聚丙烯酰胺分離凝膠，首先在80V/cm 的速度條件下進行15min，然后在120V/cm 條件下持續進行，直至電泳操作結束。由于考馬斯亮藍染色會干擾量子點的熒光強度，因此用凝膠成像儀紫外燈下觀察電泳情況，電泳結束后進行染色處理，在自然光下觀察電泳結果。

1.2.3 AFB1的檢測 將制備的AFB1人工抗原包被在微孔板上，洗滌拍干后用BSA 溶液封閉。將標準AFB1溶液梯度稀釋，稀釋倍數10－6～10－9，按濃度梯度加入離心管中，再加入適當濃度的黃曲霉毒素單克隆抗體，37℃孵育。將離心管中混合液加入包被有AFB1完全抗原的平板上，在37℃恒溫箱內孵育用PBS (0.01mol/L，pH7.4)洗滌，加入標記有CdTe 量子點的羊抗兔-IgG(二抗)孵育，洗滌拍干后加200μL/孔的超純水，置于熒光/化學發光分析儀上檢測，得到熒光強度曲線。

2 結果與分析

2.1 碲化鎘量子點納米材料的制備和表征

本試驗以鎘鹽、碲粉為基礎材料，以巰基丙酸為量子點包裹劑，利用水溶性長鏈巰基類化合物包裹的合成方法制備碲化鎘量子點，并在水相中按照不同反應時間，制備了不同發射波長的碲化鎘量子點。通過TEM觀察碲化鎘量子點的粒徑和形狀，利用熒光分光光度計對碲化鎘量子點水溶液進行光譜性質分析。分析結果顯示，本試驗所合成巰基類化合物包覆的碲化鎘量子點具有水溶性好、穩定性好、熒光量子產率高、易于生物標記等特點。由圖1 可知，試驗合成的量子點的粒徑約為5nm，呈球形分散，在水溶液中能夠較好的分散。由圖2 可知，在280nm 波長的激發光作用下，碲化鎘量子點的最大發射波長為560nm，其檢測光譜可讀性得到顯著提高。

圖1 碲化鎘量子點的透射電鏡圖

2.2 碲化鎘量子點與羊抗兔-IgG 的結合和表征

圖2 碲化鎘量子點的熒光光譜

試驗采用無毒、生物相容性良好的EDC 和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)作為羊抗兔-IgG 的交聯劑［4］，嚴格控制試驗條件，實現碲化鎘量子點與IgG 交聯，利用凝膠電泳判斷碲化鎘量子點表面是否成功標記IgG，通過SDS-PAGE 方法對CdTe 量子點與IgG 的結合情況進行表征。將CdTe 量子點、羊抗兔IgG、CdTe 量子點與IgG 結合物和蛋白質Marker 依次編號為1、2、3 和4。按照試驗方法1.2.2 操作，獲得紫外光和自然光下電泳觀察圖，以此判斷量子點與免疫球蛋白結合情況。圖3中，左圖在紫外線下觀察，可見1 道和3 道的亮帶，表明電泳物質中存在CdTe 量子點。右圖在自然光下觀察，可見2 道和3 道處于相近位置，表明電泳物質中含有羊抗兔IgG。由此可見，試驗所得碲化鎘量子點與羊抗兔-IgG 成功結合，并能夠在電泳條件下順利分離。

圖3 QDs-IgG 的12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.3 AFB1的檢測

在最佳的實驗條件下，熒光強度與AFB1濃度在稀釋10－6～10－9的倍數范圍內，即1～1 000ng/mL 下呈良好的線性關系，得到的檢出限為0.3 ng/mL (圖4)。

圖4 標準AFB1與熒光強度的關系曲線

取市場上銷售的大米，搗碎，加入不同稀釋倍數的AFB1，稀釋倍數為10－6～10－9，用本試驗方法測定熒光強度，并計算回收率，回收率89.0%～101.07% (附表)，說明本試驗所建立的新型檢測技術的靈敏度和準確性較高，可以用于實際樣品中AFB1的檢測。

附表 大米樣品中AFB1的檢測回收率

3 結論與討論

利用碲粉、水合氯化鉻和巰基丙酸在水相中成功合成了新型發光量子點碲化鎘量子點，通過TEM、熒光分光光度計的表征，表明所制備球形納米顆粒具有良好的分散性和均一性，熒光發射特征與量子點基本保持一致，光穩定性得到大幅度提高。將所制備的碲化鎘量子點納米顆粒通過EDC 和NHS 和羊抗兔-IgG 結合，然后通過電泳分析和TEM 表征，表明成功地將碲化鎘量子點與羊抗兔IgG 結合。通過對新制備的量子點與IgG 結合物進行分析性能研究，本試驗建立了適用于檢測AFB1的高靈敏分析方法，檢測限可達1 ng/mL。

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