阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列分析

牛婕婷 ，滿朝新，費 鵬，婁彬彬，李 然，柴云雷，李 理，姜毓君，

(1東北農業大學食品學院/乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030;2東北農業大學/國家乳業工程技術研究中心，哈爾濱 150028)

阪崎克羅諾桿菌(原名阪崎腸桿菌)是一種革蘭氏陰性無芽孢的兼性厭氧菌，屬于條件致病菌［1-3］。研究發現，新生兒，尤其是早產兒、低體重新生兒和出生小于28d 的新生兒為易感人群，它能引起新生兒菌血癥、小腸結腸炎和腦膜炎，致死率高達50%以上，并且幸存的患者經常會留下嚴重的神經后遺癥，而嬰兒配方奶粉是其主要的感染途徑［4-8］。

ITS (internal transcribed spacer)序列是位于操縱子上16S rDNA 與23S rDNA 間的一段間隔序列，它的長度和序列變化較大，將其擴增物進行序列分析，可用于對細菌的不同生物型、菌株、種進行分類鑒定［9］。ITS 序列鑒定與16S rDNA 序列鑒定相比具有更高的靈敏性，有研究表明，ITS 的進化速率是16S rDNA 的10 倍，相比16S rDNA 序列ITS 在細菌不同種屬間存在更大的差異，因此能夠對細菌進行鑒定分類［10，11］。本研究采用ITS 序列對37 株阪琦克羅諾桿菌進行鑒定，并針對ITS序列進行分析，構建了系統發育樹，并證實了阪琦克羅諾桿菌含不同功能基因(即tRNAile+ala以及tRNAglu)，為阪崎克羅諾桿菌的鑒定及ITS 基因的進一步分析提供了可供參考的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

本試驗所用菌株分離自2009—2012年期間不同地區生產的乳粉和嬰幼兒配方粉樣品，及某一濕法加工嬰幼兒配方粉生產企業的加工環境和成品，共計37 株阪崎克羅諾桿菌。

1.2 試驗試劑與設備

1.2.1 試驗試劑

細菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術有限公司;膠回收試劑盒，美國Omega 公司;零背景快速連接試劑盒，北京天根生物技術有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，青島海博生物有限公司;氨芐青霉素，Solarbio 公司。

1.2.2 試驗設備

移液器(德國Eppondorf 公司)、振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、精密電子天平、DHP-9272 型電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)、9700 PCR 擴增儀、DYY-10C型電泳儀、UVP 凝膠成像系統、TGC-16G 型離心機、WHF-201BJ 型紫外可見透射反射儀、電熱恒溫水浴鍋、Bcn1360 型生物超凈工作臺(上海佳勝儀器制造有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的培養

取出-80 ℃甘油保存的阪崎克羅諾桿菌的凍存管，將菌株恢復至室溫后，按2%的接種量接種于LB 液體培養基，37 ℃培養8～12 h 進行活化，活化后即可進行后續試驗如菌體DNA 的提取。

1.3.2 基因組總DNA 的提取

取新鮮活化好的菌液1 mL，按照細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書，對37 株經API20E 鑒定為阪崎克羅諾桿菌的菌株進行DNA 提取。

1.3.3 ITS 序列的擴增

以ITS 序列通用引物16 S/p2:5'-CTTGTACACACCGCCCGTC-3' 和23 S/p7:5'-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3'以37 株阪崎克羅諾桿菌全基因組DNA 為模板。50 μL 反應體系:1.0 μL 引物16 S/p2 (10 μmol/L)，1.0 μL引物23 S/p7 (10 μmol/L)，5 μL 10×Buffer (含MgCl2)，2.0 μL dNTPs (10 mmol/L)，1.0 μL Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U/μL)，2.0 μL DNA 模板(20～50 ng)，ddH2O 補加至50 μL。PCR 擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min;循環數為30 個;72℃終延伸5min;最后4℃保存。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。

1.3.4 膠回收

將PCR 產物進行膠回收試驗，具體方法參照瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒使用說明書。

1.3.5 目的片段與克隆載體的連接

試驗方法參照零背景快速連接試劑盒使用說明書。

1.3.6 轉化反應

(1)制備含有氨芐青霉素終濃度100 μg/mL 的LB瓊脂糖平板。使用前，將平板置于37 ℃培養箱中，預熱至少20 min。

(2)將10 μL 連接產物全部加入到100 μL 的TOP 10 感受態細胞中(感受態細胞儲存于-70 ℃，使用時避免反復凍融)，操作過程在冰浴上完成，待感受態剛剛解凍時加入連接產物。輕輕混勻，冰浴30 min。

(3)將反應后的混合物置于42 ℃水浴鍋中恒溫90 s，取出后立即放于冰浴中保持2～3 min，期間不要碰動離心管。

(4)向離心管中加入500 μL 37 ℃預熱的LB (不含氨芐青霉素)液體培養基，37 ℃空氣振蕩培養45 min，轉速為150 r/min。使質粒上的相關抗性標記基因表達，菌體復蘇。

(5)將離心管中的菌液混勻，用槍頭吸取100 μL菌液加到預熱的LB 瓊脂糖培養基(含氨芐青霉素)上，用涂布棒將細胞均勻涂開，待平板表面干燥后，置于37 ℃培養箱中倒置培養16 h。

1.3.7 菌落PCR 鑒定

通過菌落PCR 試驗證明質粒為含有目的基因的重組質粒。以菌落為模板，用槍頭在培養平板中隨機挑取3～6 個菌落分別進行PCR 試驗。以pZreoBack 載體特異引物23-mer:5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' 和 24-mer:5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'對PCR 引物進行目的基因擴增。50 μL 反應體系:1.0 μL 引物23-mer (10 μmol/L)，1.0 μL 引物24-mer(10 μmol/L)，5 μL 10 ×Buffer (含MgCl2)，2.0 μL dNTPs (10 mmol/L)，1.0 μL Pyrobest DNA Polymerase(2.5 U/μL)，2.0 μL 菌落DNA，ddH2O 補加至50μL。PCR 擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;循環數為30 個;72℃終延伸5 min;最后4 ℃保存。PCR 擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用凝膠成像系統進行拍照。

1.3.8 ITS 基因重組質粒的測序

將檢測有目的條帶的PCR 擴增產物和引物序列送到上海立菲生物技術有限公司進行雙向測序。測序結果用Chromas 1.45 軟件進行查閱，用DNAMAN 5.29軟件將雙向測序結果進行剪切與拼接，并將拼接后的序列在NCBI 上進行Blast 序列比對，實現對菌株的鑒定，利用MEGA 4 軟件構建系統發育樹分析。

2 結果與分析

2.1 ITS 序列的擴增

采用ITS 序列擴增通用引物16S/p2 和23S/p7，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結果如圖1 所示。

圖1 ITS 基因PCR 產物電泳圖

電泳結果顯示，阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列不唯一，有兩條條帶，條帶大小在600～800 bp 之間。高旗利［12］等對阪崎克羅諾桿菌16S—23SrDNA 序列進行PCR 擴增，發現阪崎克羅諾桿菌在rRNA 基因中有兩種操縱子，分別含有功能基因tRNAglu和功能基因tRNAile+ala，這與本研究結果相符，所以應采用克隆實現對PCR 產物的分離，并對每個克隆進行測序。

2.2 ITS 基因片段的膠回收

使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對目的片段進行膠回收，回收產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結果如圖2 所示。電泳結果顯示，在預期大小的位置出現了ITS 基因條帶，且條帶單一清晰，可用于后期與載體的連接試驗。

圖2 ITS 基因膠回收電泳圖

2.3 重組質粒的篩選

將膠回收的目的基因與pZeroBack 載體進行連接，并將連接產物轉移到Top 10 感受態細胞中進行培養。由于該載體含有致死的限制性酶基因(內含多克隆位點)，多克隆位點插入外源片段會引起酶基因失活。而無外源片段插入的載體表達致死的限制酶，所以轉化到細胞中會將細胞殺死。因此只有含目的基因的重組質粒會在平板上存活形成菌落。

2.4 菌落PCR 的鑒定

隨機挑取平板上形成的菌落，作為PCR 反應模板，以引物23-mer 和24-mer 作為擴增引物。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結構如圖3所示。

圖3 重組質粒pZeroBack:ITS 的PCR 產物電泳圖

2.5 ITS 基因序列的測定

同樣將37 株分離菌株的ITS 基因(目的基因與載體的結合)的PCR 產物送到上海立菲生物技術有限公司進行雙向測序。將測序結果經Blast 比對后，同樣結果顯示，所有菌株(包括ES59)除了ES4 以外，其余菌株與Cronobacter sakazakii 的同源性最高，相似性達99%，進一步證明所有分離菌株(除ES4)均為阪崎克羅諾桿菌。而同樣ES4 被鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。另外，測序結果發現，在36 株阪崎克羅諾桿菌中，31株菌的測序結果顯示ITS 基因含有tRNAglu功能基因，其余5 株菌的ITS 基因含有功能基因tRNAile+ala，說明G-ITS 基因為主要ITS 基因類型。有文獻報道［13］，阪崎克羅諾桿菌共有7 個操縱子，其中4 個操縱子屬于G-ITS 類型，3 個操縱子屬于IA-ITS 類型。

2.6 ITS 序列構建系統發育樹及分析

以36 株阪琦克羅諾桿菌序列及已知標株C.sakazakiiATCC12868、C.sakazakiiATCC29004、C.sakazakii-ATCC29544、E.aerogenes KCCM11783、K.pneumonia ATCC10031、S.enteric M495 等的序列為研究對象，利用MEGA 4.1 軟件分別對這兩種ITS 基因類型構建系統發育樹，參數設置為鄰接相鄰算法，Kimura 2-parameter 模式，重復次數為1 000次。

由試驗得出，5 株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌ATCC 標準菌株(含tRNAIle和tRNAAla)在同一系統發育分支下，與鑒定結果相符。將分離菌株與ATCC 標準菌株進行多重序列比對分析，結果顯示，該群內的同源性為99.29%。31 株分離菌株與阪崎克羅諾桿菌ATCC標準菌株(含tRNA-Glu)在同一系統發育分支下，腸桿菌科的其它菌株組成另一系統發育分支。將分離菌株與ATCC 標準菌株進行多重序列比對分析，結果顯示該群內的同源性為98.15%。

結果表明，36 株分離菌株共有31 株菌的ITS 序列含有功能基因tRNAgul，5 株菌含有功能基因tRNAile+ala，說明含有tRNAgul功能基因的ITS 序列是阪崎克羅諾桿菌其基因的主要類型。對這兩種基因類型分別構建系統發育樹，結果表明，這兩棵發育樹中的分離菌株都位于同一類群(Group I)，并且對群內菌株間基因同源性比對，發現無法對群內菌株進一步分型。分析原因是一方面阪崎克羅諾桿菌的ITS 序列比較保守。另一方面，在試驗中同樣采用了通用引物對ITS 序列進行擴增，降低了菌株間序列的差異性。因此后續可通過設計特異性引物對該序列測定分析，進一步分析研究。

3 結論

本試驗利用ITS 序列基因測序的方法對37 株經API20E 生化鑒定為阪崎克羅諾桿菌的分離株進行了進一步的鑒定分析，結果表明，已ITS 序列測序進行阪崎克羅諾桿菌的鑒定更具準確性。此外本試驗通過進一步的ITS 序列分析，發現了ITS 序列含有功能基因tRNAgul和功能基因tRNAile+ala兩種功能基因，且功能基因tRNAgul占優勢地位。基于以上研究說明，ITS 序列可作為阪崎克羅諾桿菌的標記性基因，用于對阪崎克羅諾桿菌的鑒定和快速檢測的研究，這部分研究內容也為ITS 序列數據庫的豐富及在細菌分類鑒定積累了經驗。

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