前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

蘇曉娜，李高偉，張培熾，王　閣(綜述)，王　東※(審校)

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400700)

前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

蘇曉娜1，李高偉2，張培熾1，王閣1(綜述)，王東1※(審校)

(1. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400700)

摘要：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTCs的臨床應(yīng)用對實體惡性腫瘤的準(zhǔn)確監(jiān)測和療效觀察提供了一種無創(chuàng)性新方法。盡管前列腺癌的具體病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，但CTCs作為患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，在前列腺癌的早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估及指導(dǎo)個體化治療中具有重要的臨床意義。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測方法

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌發(fā)病率居全球男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，是威脅男性健康和生命的重要惡性疾病之一[1]。前列腺癌的發(fā)病是多因素相互作用的復(fù)雜過程，目前尚缺乏有效的預(yù)防方法，術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2-3]。高特異性的監(jiān)測指標(biāo)及高敏感性的檢測方法對患者術(shù)后療效及復(fù)發(fā)的監(jiān)測具有重要意義。研究證實，前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)密切相關(guān)[4-5]。通過檢測CTCs不僅有助于正確評估病情，而且治療期間連續(xù)監(jiān)測CTCs的變化水平還可及時、準(zhǔn)確地反映治療效果，判斷治療方案的敏感性。現(xiàn)就前列腺癌CTCs研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1CTCs的檢測

血液中CTCs 數(shù)目極少，約每10億個正常血細(xì)胞中才會發(fā)現(xiàn)1個，常規(guī)的血清學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)等檢查方法很難檢測到[6]。骨髓檢測相對容易得到標(biāo)本，但屬于有創(chuàng)操作，臨床連續(xù)檢測可重復(fù)性不高。由于外周血含量極低，因此在進(jìn)行檢測和生物學(xué)分析前首先應(yīng)對血樣中CTCs進(jìn)行富集，以提高檢測的靈敏度。

1.1CTCs分離富集方法 CTCs的臨床和生物學(xué)應(yīng)用很大程度上依賴于所使用的分離技術(shù)。不同方法在敏感性和分離效率等方面存在差異，加之CTCs的異質(zhì)性，不同技術(shù)往往能分離出不同細(xì)胞亞群，產(chǎn)生不同的生物學(xué)特征。常用的富集方法多基于CTCs的物理特性或免疫磁性。

1.1.1密度梯度分離法 密度梯度分離法主要依據(jù)血液中各細(xì)胞成分的密度不同，經(jīng)過離心后各細(xì)胞成分在細(xì)胞分離液中呈現(xiàn)梯度分布，從而將各種細(xì)胞加以分離。密度梯度分離法的局限性主要是敏感度較低，容易造成缺乏相應(yīng)密度的腫瘤細(xì)胞丟失[7]。

1.1.2膜濾過分離法膜濾過分離腫瘤細(xì)胞主要依據(jù)濾過細(xì)胞的大小進(jìn)行分離，較小的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可通過微孔濾去，而較大的腫瘤細(xì)胞則被阻滯在膜上。該方法操作簡單，靈敏度較高，可達(dá)1個腫瘤細(xì)胞/mL外周血[8]。膜濾過分離法不僅可用來計數(shù)CTCs，還可進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞染色、免疫標(biāo)記、熒光原位雜交等分析，但缺乏特異性，易丟失直徑<8 μm和正發(fā)生溶解的腫瘤細(xì)胞。

1.1.4微流體芯片分離法微流體芯片分離技術(shù)和其改進(jìn)技術(shù)HBCTC-Chip (herringbone-chip)均能檢測出血液中極微量癌細(xì)胞。CTC-Chip在970 mm2的芯片表層排布了78 000個包被抗體的微柱定位點，抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合，促使CTCs最大限度黏附于芯片上，血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞則從芯片洗滌清除，然后CTCs進(jìn)行計數(shù)或用分子特征鑒定的方法進(jìn)行分析。Nagrath等[12]對來自上皮細(xì)胞腫瘤患者的116份血樣進(jìn)行CTC-Chip檢測，115份(99%)血樣中檢測到CTCs，其中7例早期前列腺癌患者血樣中均檢測到CTCs，具有較高的靈敏度和特異度。該方法無需通過有創(chuàng)手段取得實體腫瘤組織即可對病灶進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，因此又被稱為“液體活檢”[13]。

1.2CTCs分析技術(shù)CTCs是從機體實體腫瘤上脫落，然后進(jìn)入血液循環(huán)的。分析技術(shù)能夠在400億血細(xì)胞中辨別和計數(shù)少量的CTCs，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師對患者的治療決策。通過分析CTCs的系列測量結(jié)果，結(jié)合其他的臨床監(jiān)測方式，醫(yī)師就能把握疾病的進(jìn)展，指導(dǎo)患者在掌握更多信息的基礎(chǔ)上更早地進(jìn)行治療。分析技術(shù)主要依據(jù)前列腺CTCs本身的形態(tài)學(xué)特征或腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些特異性標(biāo)志物來檢測分析CTCs，主要包括免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、光導(dǎo)纖維陣列掃描技術(shù)、激光掃描細(xì)胞計量技術(shù)等。

1.2.1免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是以顯色劑(熒光素、酶等)標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物(CK、上皮細(xì)胞膜特異性抗原等)結(jié)合顯色，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性測定的技術(shù)。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是CTCs檢測的重要方法之一，但由于其靈敏度只有105左右，且分化較差的腫瘤細(xì)胞對目標(biāo)抗原的表達(dá)較弱或不能表達(dá)，均易導(dǎo)致假陰性[14]。這些在一定程度上限制了免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是一項集激光、電子物理、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)等為一體的新型技術(shù)。它利用腫瘤細(xì)胞單抗結(jié)合熒光物質(zhì)使腫瘤細(xì)胞染色，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析，染色細(xì)胞被視為陽性。其優(yōu)點主要是可以定量計算腫瘤細(xì)胞數(shù)目，并且可以對細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，測量速度較快，但流式細(xì)胞術(shù)檢測靶細(xì)胞的靈敏度較低，僅為1/104～1/105，而采用免疫磁性分離法首先進(jìn)行富集再進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析則可顯著提高檢測CTCs的敏感性[15]。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測CTCs是基于組織或腫瘤細(xì)胞某些基因改變后DNA水平異常或特異性信使RNA的表達(dá)來間接測定CTCs的存在。該方法靈敏度較高，可在107～108個外周血單核細(xì)胞中檢測到單個腫瘤細(xì)胞[16]。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)最重要的缺陷是無法進(jìn)行CTCs計數(shù)，因此無法實現(xiàn)CTCs數(shù)目的連續(xù)監(jiān)測；另外，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)是以腫瘤標(biāo)志物的信使RNA為標(biāo)志物，易受到靶基因在正常細(xì)胞中的表達(dá)、偽基因的擴(kuò)增及操作過程中污染等因素影響。Kowalewska等[17]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可引起腫瘤抗原信使RNA的升高使檢測出現(xiàn)假陽性，因此提出運用多標(biāo)志聯(lián)合檢測法在一定程度上可彌補由于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性及個體間表達(dá)差異造成的假陰性或假陽性。

2CTCs的臨床應(yīng)用

2.1CTCs與前列腺癌預(yù)后CTCs在局限性前列腺癌的臨床應(yīng)用中目前仍存在一定爭議，但在進(jìn)展和轉(zhuǎn)移性前列腺癌的臨床應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可[18]。Okegawa等[19]對76例激素難治性前列腺癌患者外周血采用CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行CTCs檢測，分析基線CTCs計數(shù)與患者總生存期的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，基線CTCs計數(shù)≥5的患者(47例)總生存期為12.0個月，顯著短于基線CTCs計數(shù)<5的患者(26.0個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，并且前者的死亡風(fēng)險明顯高于后者，可見基線CTCs計數(shù)可作為總生存期的獨立預(yù)后因素。Danila等[20]運用類似方法對120例去勢抵抗性前列腺癌患者進(jìn)行研究，分析基線CTCs計數(shù)及化療過程中數(shù)目的變化與總生存期的關(guān)系；研究發(fā)現(xiàn)，99例血樣(82%)中檢測到CTCs，其中69例血樣(57%)基線CTCs計數(shù)≥5，且治療前后CTCs計數(shù)均≥5的患者預(yù)后較差，治療后CTCs計數(shù)<5的患者有著相對較好的預(yù)后，說明CTCs計數(shù)及治療后數(shù)目的變化均是總生存期的獨立預(yù)后因素。

2.2CTCs與前列腺癌治療監(jiān)測抗腫瘤治療療效的檢測是CTCs的臨床重要領(lǐng)域之一，CTCs檢測可作為影像學(xué)及臨床其他檢查體系的有力補充。通過對CTCs數(shù)目的監(jiān)測，不僅能夠準(zhǔn)確監(jiān)測腫瘤治療效果、判斷疾病的進(jìn)展，同時由于其操作簡便、無創(chuàng)，還能對患者進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，及時對治療應(yīng)答作出評估調(diào)整，CTCs在監(jiān)測各類惡性腫瘤對治療方案反應(yīng)的研究中逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)勢。Stott等[21]使用CTC-Chip技術(shù)對19例局限性前列腺癌患者外周血進(jìn)行CTCs計數(shù)研究，8例患者檢測到CTCs，術(shù)后24 h再次檢測，8例患者中6例CTCs計數(shù)明顯下降，另外2例患者在術(shù)后3個月內(nèi)也明顯下降，術(shù)后1年內(nèi)均未檢測到復(fù)發(fā)。Scher等[22]對164例去勢抵抗性前列腺癌患者進(jìn)行類似研究，發(fā)現(xiàn)大部分患者在治療后CTCs計數(shù)明顯下降，并且CTCs計數(shù)變化與生存時間之間關(guān)系密切。

2.3CTCs作為實時“病理標(biāo)本”進(jìn)一步指導(dǎo)個體化治療隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對前列腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制有了進(jìn)一步的認(rèn)識，前列腺癌分子標(biāo)志物研究也逐漸受到廣泛關(guān)注。目前已知的與前列腺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素包括雄激素受體基因的擴(kuò)增和突變、跨膜絲氨酸蛋白酶2基因融合、表皮生長因子受體的表達(dá)及人類第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因等[23]。CTCs的檢測可幫助進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞的遺傳背景，從而針對性研究阻斷相應(yīng)受體的藥物，提高治療的針對性和有效性。晚期前列腺癌患者雄激素受體信號仍是疾病進(jìn)展的重要途徑。多西他賽是第1個被證實能延長晚期前列腺癌患者生存期的雄激素受體抑制類藥物。Galsky和Vogelzang[24]對接受多西他賽治療的去勢抵抗性前列腺癌患者外周血CTCs進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，患者對多西他賽的敏感性與CTCs中雄激素受體水平相關(guān)，對化療有效的患者CTCs中雄激素受體水平明顯低于耐藥患者，提示可通過外外周血CTCs中雄激素受體水平來間接預(yù)測患者對多西他賽的敏感性。這與Pantel和Alix-Panabieres[13]的研究結(jié)果一致。可見，外周血CTCs檢測可反映患者對治療藥物和方案的敏感性，進(jìn)而指導(dǎo)臨床選擇個體化治療方案。

3小結(jié)

前列腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移是多因素作用的復(fù)雜過程，CTCs在前列腺癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中起著重要作用，為判斷疾病的預(yù)后及指導(dǎo)個體化治療提供了新的思路和方法。目前CTCs各種檢測技術(shù)之間特異性和敏感性不同，各實驗室間又未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等因素均對其臨床廣泛應(yīng)用帶來挑戰(zhàn)。因此,進(jìn)一步完善CTCs的臨床研究，探究標(biāo)準(zhǔn)化敏感檢測方法，可為前列腺癌的早期診斷、療效判斷及指導(dǎo)治療創(chuàng)造新的機遇。

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Research Progress in the Clinical Application of Circulating Tumor Cell in Prostate Cancer Progression

SUXiao-na1,LIGao-wei2,ZHANGPei-chi1,WANGGe1,WANGDong1.

(1.CancerCenter,DapingHospitalandResearchInstituteofSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China； 2.DepartmentofOncologyChongqingBeibeiDistrictTCMHospital,Chongqing400700，China)

Abstract：Circulating tumor cells(CTCs) refer to the tumor cells that get into peripheral blood circulation spontaneously or along with some operations for diagnosis and treatment.The clinical application of CTCs provides a non-invasive method for accurate monitoring and clinical observation in prostate cancer.Though the exact pathogen of prostate cancer is unclear,CTCs is an important factor of recurrence and distant metastasis,which has an important clinical significance for early diagnosis,monitoring,prognosis evaluation and guiding individualized treatment.

Key words：Prostate cancer； Circulating tumor cells； Detection methods

收稿日期：2015-06-29修回日期：2015-08-11編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.024

中圖分類號：R73725

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4291-03