STAT3基因siRNA表達載體的構建及鑒定

劉　洋，靳秋月，段美慶，樊淑珍，陳立軍※

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤學院生物化學教研室，天津 300309)

STAT3基因siRNA表達載體的構建及鑒定

劉洋1，靳秋月2，段美慶1，樊淑珍1，陳立軍2※

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院檢驗科，呼和浩特 010059； 2.武警后勤學院生物化學教研室，天津 300309)

摘要：目的利用RNA干擾技術，以信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)為靶基因，設計構建重組體，并進行序列分析鑒定。方法設計一條有小發夾結構的DNA序列，聚合酶鏈反應(PCR)擴增合成siRNA表達框架(SECs)表達框架，克隆至載體psiLentGeneTM中構建重組體，轉化E.coli DH5α菌株，提取質粒進行酶切鑒定后測序分析。結果重組質粒經EcoRⅤ酶切、電泳、測序分析表明插入序列正確，重組質粒構建成功。結論成功構建了STAT3靶向RNA干擾重組體，為腫瘤的基因治療在分子水平、細胞水平和整體水平的研究提供一些新方法。

關鍵詞：信號轉導和轉錄激活因子3；RNA干擾；質粒

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是基因轉錄后沉默的一種重要機制，其是通過核酸酶切割雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA),將其變成21～25 nt的小干擾RNA(small minterfering RNA，siRNA)，通過siRNA介導識別，然后靶向切割同源性信使RNA分子而實現的[1-2]。RNAi技術是一種高效的特定基因表達調控的新技術，作為分子生物學研究的重要工具之一，被廣泛用于功能基因組研究以及腫瘤基因治療研究[3-7]。siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一段DNA序列，該序列可在哺乳動物細胞中表達siRNA，其由3部分組成，包括RNA聚合酶啟動子、發夾式siRNA模板以及RNA聚合酶終止子，RNA聚合酶Ⅲ能夠識別啟動子，從而轉錄產生siRNA分子，進一步引發RNAi[8-10]。本實驗成功構建了針對信號轉導和轉錄激活因子3(signal transduction and activators of transcription，STAT3)的siRNA表達載體，這為沉默STAT3基因的表達及腫瘤的靶向治療提供了基礎，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料E.coli DH5α感受態細胞及質粒提取試劑盒均由北京天根公司提供；產物純化試劑盒由美國PROMEGA公司提供；Marker由北京天根公司提供。Luria-Bertani(LB)液體及固體培養基自行配置。STAT3基因片段由上海賽百盛公司合成。

1.2方法

1.2.1設計STAT3特異性的siRNA通過查詢Genebank，獲取人的STAT3信使RNA全序列(序列號：NM003150)。根據干擾RNA設計原則，尋找到干擾RNA的靶序列。確認此靶向基因是唯一的、對于STAT3是特異的，且此部位無堿基多態性，同時不會抑制其他基因的表達。該序列經過BIast，搜尋EST基因庫得到。1426～1444的核苷酸堿基序TTGAATTCTGCAGAGAGGC為RNA的干擾序列。按照天根公司的siLentGeneTMU6盒提供的干擾RNA引物設計原則，構建序列下游引物。該引物須包括：5′磷酸堿基、局部的EcoRⅤ序列、U6終止序列、回文莖環結構(由靶序列和袢環以及靶序列的反義互補組成)以及U6盒的配對序列，引物序列為5′-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCTTGAATTGAA-TTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA -3′。

1.2.2SECs的體外合成用試劑盒擴增發夾結構，用siLentGeneTM聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR) DNA純化系統進行PCR產物純化，最后用2%瓊脂糖進行純化產物凝膠分析。

1.2.3載體與siRNA模板的連接將前期純化好的PCR產物與psiLentGeneTM載體建立連接體系，充分混勻，室溫孵育1 h。同時設置空質粒對照。

1.2.4連接產物的轉化重組質粒和空質粒用熱激方法分別轉入到感受態細胞大腸埃希菌DH5α中，將已轉化的感受態細胞加到含氨芐西林抗生素的LB固體培養基，用無菌彎頭玻棒均勻涂開細胞，把平板倒置，37 ℃培養12～16 h[11-12]。

1.2.5陽性重組克隆的篩選通過藍白斑法，挑選白色菌落接種到含有氨芐西林的LB培養基中，在37 ℃溫箱中振蕩過夜培養，然后將培養的細菌菌液使用質粒小提試劑盒提取可能的菌落質粒[13]。

1.2.6重組質粒的鑒定重組質粒用EcoR Ⅴ限制性內切酶進行酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，酶切產物送大連寶生物工程有限公司進行測序分析。

2結果

2.1SECs的體外合成以發夾式siRNA模板寡聚核苷酸為模板合成SECs，2%瓊脂糖凝膠電泳，SECs條帶位置在300 bp左右(圖1) 。

2.2重組質粒的酶切鑒定質粒psiLentGeneTM上含有EcoR Ⅴ的酶切位點，插入目的基因片段后，如若插入正確，則能被EcoRⅤ酶切出一條約為300 bp的小帶和一條大小相似于原載體約4000 bp的條帶。堿裂解法小量提取質粒，質粒DNA用EcoR Ⅴ酶切，酶切后的產物在1%瓊脂糖凝膠電泳中得到了大小為4000 bp和300 bp的條帶(圖2)。

2.3測序結果由PCR合成的STAT3-siRNA表達盒，凝膠電泳顯示合成片段的大小與實驗設計相符，約為300 bp，經過測序分析證實STAT3-siRNA表達盒的序列與實驗設計序列相符，共474 bp。序列由大連寶生物工程有限公司進行測序，由此來證實所得到的重組載體序列正確(圖3)。

1、2、3、4：SECs；5：Marker

1：空質粒；2、3：EcoRⅤ酶切圖；4:Marker

注：STAT3-siRNA表達盒序列測序結果與設計的約300 bp干擾序列完全一致

圖3重組載體測序圖

3討論

STAT蛋白家族能夠被不同的細胞因子受體激活，是細胞因子與受體相互作用的載體，其能保持信號在細胞內傳遞的特異性。在STAT蛋白家族中，異常活化的STAT3及其相關基因與許多惡性腫瘤關系密切[14]。研究表明，酪氨酸激酶信號轉導途徑的異常與一些疾病關系密切，STAT3的異常高表達和持續激活存在于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及多發性骨髓瘤等腫瘤細胞和組織中，其對于腫瘤細胞的形成、增殖、凋亡抑制等過程有重要作用[15-19]。

沉默STAT3基因可能會給腫瘤治療帶來新的方向，目前有多種方法可抑制基因的表達，但研究的焦點還是RNAi，尤其是siRNA[20-22]。許多研究表明，siRNA可高效阻斷哺乳動物細胞中某些特定基因的表達[23-24]。與RNA正義和反義RNA基因干涉相比，siRNA的效果更強、持續時間更長，甚至可延續到下一代，其也不受注射部位的影響。

目前，siRNA的研究多采用體外轉錄法、PCR法、RNA合成法、質粒或病毒載體法等[25]。體外合成siRNA比較方便，其抑制效果也較好，容易實現，適合快速篩選所需要的序列，但不能用于長期介導RNAi，用于基因治療時RNA會被RNase降解，因此無法滿足動物和人體研究的要求。此外，還有一個重要問題，即RNAi衰減，對于低級生物，dsRNA或siRNA產生的RNAi能夠穩定表達，并產生放大效應；但在較高級的哺乳動物和人類細胞內缺少RNAi的放大機制，在原代細胞中有時會對導入的dsRNA或siRNA產生拮抗，在轉染陽性的細胞內這種現象在數天后會慢慢消失[25]。雖然siRNA表達載體需要克隆，且需要經過序列檢測來證實，但這種方法容易大量擴增載體，且構建好的質?？砷L期使用，是一種可以進行長期研究的方法。一般使用的siRNA表達載體是能夠在哺乳動物細胞中有效表達的短發卡結構RNA，它是含有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的載體[26]，如人源H1啟動子和人源或鼠源U6啟動子，它們的區別僅是轉錄起始點的堿基稍有不同，這些啟動子能夠在哺乳動物細胞中由RNA聚合酶Ⅲ啟動子操縱一段小的發夾siRNA表達干擾作用。U6啟動子在細胞內表達豐富，其能夠精確地起始和終止真核細胞內RNA的轉錄：限制性內切酶正好切斷U6啟動子的轉錄起始位置，能直接插入siRNA序列，轉錄后不需要切除額外堿基[27]。本研究設計時，在RNA聚合酶Ⅲ啟動子與4～5個T(終止RNA的轉錄)之間插入一段反向重復的回文序列，兩個反向重復序列間有一個環狀結構，該結構最好是由9個堿基的間隔區來形成，從G或A開始轉錄，于轉錄終止位置的第2個堿基處終止，最后折疊成一個具有3′UU突出末端的莖環結構。在體內，Dicer將該結構切割成具有活性的siRNA分子，最終發揮RNAi作用。該表達載體具有以下優勢：①操作過程比較簡單，不用提取對實驗條件要求苛刻的RNA；②能夠長時間抑制目的基因的表達；③可以復制擴增載體(如質粒或病毒)[28]，與化學合成法相比，可顯著降低制備siRNA的成本。該方法適用于研究需要用抗生素篩選才能表達siRNA的細胞和維持較長時間基因沉默的細胞，不適用于siRNA序列篩選。目前，質粒法已成為研究的熱點。

該實驗成功地構建了能夠阻斷STAT3基因表達的干擾RNA序列，并同時將該序列克隆到載體psiLentGeneTM中，其為今后的研究打下了堅實的基礎，為腫瘤的基因治療在分子水平、細胞水平和整體水平的研究提供一些新方法。

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The Building and Identification of siRNA STAT3 Gene Expression Vector

LIUYang1，JINQiu-yue2，DUANMei-qing1，FANShu-zheng1，CHENLi-jun2

(1.DepartmentofLaboratoryAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010059,China; 2.DepartmentofBiochemistry，LogisticsInstituteofPolice，Tianjin300309,China)

Abstract：ObjectiveThis study used RNA interference technology,selected STAT3 gene as the target,and then design and construction a recombinant vector and then identification the gene sequence analysis.MethodsDesign a DNA sequence with a small hairpin structure,PCR amplification a siRNA expression cassettes,cloning vector to construct recombinants in psiLentGeneTM into E.coli DH5α strain,extract plasmid after enzyme digestion sequencing.ResultsRecombinant plasmid by EcoR Ⅴ enzyme,electrophoresis and Sequencing analysis showed that the inserted sequence is correct,the recombinant plasmids were successfully constructed. ConclusionThe successful construction of STAT3 targeted RNA interference recombinant,provides some new methods for gene therapy of cancer research at the molecular level,cellular level and the overall level of.

Key words：Signal transduction and activators of transcription3; RNA interference; Plasmid

收稿日期：2014-04-15修回日期：2014-11-27編輯：辛欣

基金項目：武警醫學院總部級科研項目(WKH2006-6)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.053

中圖分類號：R735.35

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)04-0715-04