高頻腦深部電刺激對帕金森病模型大鼠丘腦底核神經元放電的影響

周麗娜，王洪新

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常見的一種以運動遲緩、強直、靜止性震顫和姿勢反射障礙為主要臨床癥狀的神經系統退行性疾病。腦深部電刺激術(deep brain stimulation，DBS)是將電極埋植于腦深部特定的神經核團，通過顱外腦刺激器發生電脈沖刺激來達到治療目的。法國的Benabid 醫生最初在作核團毀損術前用100～180 Hz 高頻刺激來測定手術毀損范圍時，發現高頻刺激可使PD 癥狀改善，頻率較低時則沒有此效果，從而開創了腦深部電刺激術［1］。目前手術常用靶點有丘腦底核(subthalamic nucleus，STN)、蒼白球內側核(globus pallidus internus，GPi)和丘腦腹中間核(ventral intermediate nucleus，Vim)，其中STN-DBS 對震顫、強直、運動遲緩和異動癥的治療效果最為顯著，能顯著減少用藥劑量，并具有非破壞性、可調節性、可逆性和并發癥少等優點，是最為理想的刺激靶點。雖然STN-DBS 的臨床效果得到肯定，但其作用機理仍不十分清楚。基于此，本研究選用STN 為研究對象，記錄正常大鼠和帕金森病大鼠STN-DBS 前后STN 的細胞外放電，分析了其放電頻率和放電形式，來進一步的探討高頻電刺激STN 治療PD 的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 選用健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠30 只，質量260～290 g，由北京維通利華實驗動物有限公司［動物許可證號:SXCK(京)2002-0003］提供。大鼠在標準環境飼養，室溫20～28 ℃，24 h 晝夜循環光照，自由飲水進食。動物經行為學測試無旋轉行為后進行下一步實驗。將大鼠隨機分為2 組:正常對照組(n=10)、帕金森病模型組(n=20)。

1.1.2 儀器 腦立體定位儀(美國)、牙科鉆(STRONG 90)(韓國)、DigiData 1322A 型生物電信號采集與分析系統(美國Axon 公司)、微電極放大器(AxoClamp-2B)(美國Axon 公司)、手術顯微鏡(YZ20P5)(美國)、微電極推進器(MS314)(美國Axon 公司)、光學顯微鏡(日本Olympus 公司)、電刺激器(SEN-7203)(日本SEN 公司)。

1.1.3 試劑 水合氯醛、烏拉坦、氯化鉀、6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 帕金森病大鼠模型的建立 采用6-OHDA 化學性毀損黑質致密部(substantia nigra compacta，SNc)的多巴胺能神經元的方法建立PD 模型。首先將2 mg 6-OHDA 溶于700 μl 含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中(濃度約為3 mg/ml)，并置于冰盒內，避光保存。將SD 大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將其俯臥位固定于腦立體定位儀上。沿頭頂部正中切開頭皮和皮下組織，暴露前囟。采用兩點注射法，根據包新民等［2］著的大鼠腦立體定位圖譜，選擇左側SNc 兩點坐標分別為:前囟后5 mm，中線旁開1.9 mm，硬膜下8.0 mm 和前囟后5 mm，中線旁開1.8 mm，硬膜下8.0 mm。做好標記后用牙科鉆沿兩點周圍開一小骨瓣，并在手術顯微鏡下掀除硬腦膜，暴露腦組織。用10 μl Hamilton 微量注射器通過立體定位注射儀每點注射6-OHDA 溶液4 μl(12 μg)，注射速度為l μl/min，留針10 min，而后緩慢退針，消毒后縫合皮膚。腹腔注射青霉素100000 IU 預防感染。將術后的大鼠置于安靜保溫處直至清醒，自由進食飲水。毀損4 w 后，給大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘發旋轉行為。于注藥后5 min 內出現向健側(毀損對側)旋轉，身體呈環形，首尾相接，并且30 min 內平均速度大于7圈/分為成功的帕金森病大鼠模型。

1.2.2 STN 電刺激 電生理記錄在APO 誘發后2 w 進行，將兩組大鼠用30%烏拉坦(1.0 g/kg)腹腔麻醉后置于立體定向儀上，按包新民等的大鼠腦立體定位圖譜確定右側STN 坐標為前囟后3.4～4.2 mm，中線旁開2.0～3.0 mm，硬膜下7.2～8.3 mm。STN 上方的顱骨和硬腦膜被小心移除，把一尖端直徑為200 μm 的同心圓刺激電極通過立體定向方法，在矢狀面上垂直前傾20°插入STN。通過刺激器進行電刺激，刺激參數為頻率130 Hz，波寬0.06 ms，電流強度0.4 mA，刺激時間10 s。

1.2.3 STN 神經元細胞外記錄 采用玻璃微電極細胞外記錄法記錄STN 刺激前120～180 s，刺激中(10 s)和刺激后120～180 s 的STN 神經元放電。電極尖端直徑1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液為含1%滂胺天藍的3 mol/L 氯化鉀溶液。細胞放電經微電極放大器(AxoClamp-2B)和生物電信號采集與分析系統顯示于計算機，做實時觀察、儲存，而后用Spike2 軟件分離出信噪比大于或等于3∶ 1的信號進行信號分析。進行信號分析。采樣時間5～20 min。整個實驗過程中將大鼠直腸溫度維持在37 ±0.5 ℃。每組記錄結束后，給予20 μA 陰極電流10～15 min，微電泳滂胺天藍到最后一個記錄位點。

1.2.4 組織學定位及形態學觀察 電生理記錄完畢后，將大鼠在過量麻醉下斷頭取腦，將鼠腦置于4%甲醛溶液中24 h。行連續冠狀石蠟切片，并進行HE 染色，以確定記錄點的位置和SNc 毀損情況。

1.3 統計學處理 對記錄點在STN 內的神經元的電活動進行統計分析，記錄位置在STN 之外的神經元信號棄之不用。實驗數據采用SPSS11.5 for windows 統計軟件包進行統計分析。分析刺激前每個STN 神經元的基礎放電活動并計算平均放電頻率。放電頻率采用表示。通過獨立樣本t 檢驗比較對照組和PD 組大鼠STN 神經元放電頻率，通過χ2檢驗比較兩組大鼠STN 神經元放電形式，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 PD 模型的行為檢測 進行造模的20 只大鼠，12 只誘發旋轉成功，2 只死亡。對照組大鼠無死亡。

2.2 組織學檢測 分別觀察和分析了對照組大鼠STN 中的42 個神經元和PD 組大鼠STN 中的48 個神經元，病理結果顯示刺激點和記錄點均位于STN 內。成功誘發的PD 組，毀損區結構紊亂，SNc神經元消失，膠質細胞增生。

2.3 STN 神經元自發放電活動 對照組大鼠神經元的放電頻率為16.21 ±1.26 Hz，PD 組大鼠神經元放電頻率為17.56 ±1.02 Hz，兩組放電頻率無顯著差異(P ＞0.05)(見表1)。在對照組大鼠，STN神經元表現出3 種放電形式，規則放電的神經元25個(60%)，不規則放電的神經元11 個(25%)，爆發式放電的神經元6 個(15%)。PD 組大鼠STN 神經元也表現出3 種放電形式，規則放電的神經元6 個(14%)，不規則放電的神經元10 個(20%)，爆發式放電的神經元32 個(66%)(見圖1)。經χ2檢驗，對照組和PD 組大鼠STN 神經元放電形式的總體分布不同，PD 組大鼠STN 神經元中爆發放電的神經元明顯多于對照組，而規則放電的神經元顯著少于對照組(P ＜0.01)(見表1、圖2)。

圖1 對照組和帕金森病組大鼠STN 神經元的放電形式

圖2 對照組和PD 組大鼠STN 神經元放電形式比較

表1 對照組和PD 組大鼠STN 神經元放電形式比較

2.4 電刺激STN 對STN 神經元放電的影響在對正常對照組和PD 組STN 高頻刺激過程中，共觀察到4 種不同類型的反應(見圖3)。正常對照組在10 s 的刺激過程中，放電頻率的顯著下降(71%)或甚至完全抑制電活動(14%)占絕大多數。平均放電率由刺激前16.21 ±1.26 Hz 到刺激中的8.34±1.12 Hz。只有5%的神經元放電率增加，10%的神經元放電率沒有變化。PD 組在電刺激過程中也出現放電率的顯著降低(60%)或完全性抑制(17%)。平均放電率為由刺激前17.56 ±1.02 Hz到刺激中的3.34 ±1.02 Hz。放電率增加的神經元上升至6%，17%的神經元放電率沒有變化(見表2)。

圖3 高頻電刺激過程中STN 神經元的4 種反應類型

表2 電刺激STN 對STN 神經元放電的影響

3 討論

STN 在基底節運動調控系統中占據重要地位。其通過傳入和傳出纖維與大腦皮質、蒼白球、黑質和腦干等與運動調控的相關結構存在廣泛聯系。抑制性的蒼白球外側部(globus pallidus pars externa，GPe)-STN 通路和興奮性的STN-黑質網狀部(substantia nigra pars reticularis，SNr)/蒼 白 球 內 側 部(globus pallidus pars interna，Gpi)通路，是STN 主要的生理調節系統。因此STN 被描述成基底節活動的“動力”源泉。PD 狀態下在間接通路中，因SNc至紋狀體的多巴胺(dopamine，DA)能通路變性，引起紋狀體神經元D2 受體的抑制減弱，于是自紋狀體至GPe 的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能作用加強，GPe 處的GABA 能神經元受到過分抑制，自GPe 至STN 的GABA 能通路的抑制作用減弱，從而導致STN 的作用過強，又因STN 作用過強就轉而引起Gpi/SNr 復合體對丘腦抑制性作用加強。導致丘腦對皮質運動區的興奮作用減弱，故PD患者運動減少、肌強直、平衡障礙、姿勢異常和語音低沉。還有研究表明STN 高興奮性可是SNc 放電產生同步化效應，導致SNc 多巴胺能神經元釋放DA 增加，暫時維持腦內直接通路與間接通路的相互平衡，而STN 興奮性傳出纖維過度釋放谷氨酸(glutamic acid，Glu)，促進DA 能神經元的損傷，從而加速PD 癥狀的發展［3］。因此STN 的過度活性和其傳出靶區的過度興奮現在已被認為是PD 的病理生理標志。

近十年來，STN 的高頻電刺激術(high-frequency stimulation，HFS)正被越來越多的用于治療PD。雖然其的臨床效果得到肯定，但其作用機理仍不十分清楚。目前認為DBS 治療帕金森病的可能機制有［4～6］:(1)DBS 能提高紋狀體區多巴胺的代謝活性，并增加乙酰膽堿M 受體從STN 轉移到丘腦，提高丘腦乙酰膽堿的濃度。(2)DBS 能增加丘腦、小腦、中腦和皮質區域的血流量。(3)DBS 能抑制從STN 到其他靶點投射的谷氨酸神經纖維的活性，降低興奮性神經元的過度激活。(4)DBS 能對異常STN 神經元興奮性的調控，改變相關的聯系核團的異常功能狀態，使基底核運動環路正常調控功能重新恢復。

基于以上研究的基礎，本研究選用6-OHDA 單側毀損制備的旋轉PD 大鼠模型，探討STN-DBS 治療帕金森病的機制。本研究結果表明，電刺激前PD模型大鼠STN 神經元放電頻率與對照組無顯著差異，而放電形式發生改變，正常大鼠大部分STN 神經元表現為規則或不規則放電，PD 模型大鼠爆發放電的神經元顯著增多，這和既往的研究結果基本一致。在同樣的放電頻率下，爆發放電比規則放電更有效，因此爆發放電可以說是高興奮性，進一步證實了PD 狀態下STN 神經元的過度活性。同時本研究表明，高頻電刺激兩組大鼠丘腦底核神經元后，兩組丘腦底核神經元放電都主要表現為部分抑制或完全抑制，與以往的研究結果有較好的一致性［7，8］。該研究結果支持了高頻刺激可失活刺激點附近的神經細胞，抑制丘腦底核的異常放電活動，這可能是腦深部電刺激治療帕金森病的可能機制之一。本實驗提示HFS-STN 可能通過抑制STN 的過度活性而改善帕金森病的癥狀。

綜上，本研究采用細胞外單位記錄的方法記錄刺激前和刺激過程中丘腦底核神經元的放電，結果表明爆發式放電增多可能是帕金森發病潛在的電生理基礎，高頻電刺激丘腦底核可抑制丘腦底核的異常放電活動，這可能是腦深部電刺激治療帕金森病的可能機制之一。但基底節神經環路相當復雜，有關帕金森病的病理生理學機制及HFS-STN 治療帕金森病的機制還有待更深入的研究。

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