缺血性腦卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體及危險(xiǎn)因素分析

王瑋瑤 ，孫文萍，于洪泉，鄭中華，趙東海，楊淑艷，齊 玲

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是除了高血壓、糖尿病、心臟疾病、吸煙、飲酒等傳統(tǒng)病因外的又一個(gè)引起缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素［1］。Hcy 增高引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損等病理變化可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生和復(fù)發(fā)［2～5］。實(shí)際上體內(nèi)70%～90%的Hcy 是以同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)的形式存在，這種形式的Hcy 遠(yuǎn)大于游離Hcy 和同型半胱氨酸硫內(nèi)酯的含量，而被修飾后的蛋白質(zhì)又會(huì)被機(jī)體識(shí)別成異體蛋白，引起一系列的免疫反應(yīng)。因此，我們推測(cè)同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體可能會(huì)與Hcy 一樣成為缺血性腦卒中致病的重要組成部分。這方面研究國(guó)內(nèi)還未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者血清中Hcy 及同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體等指標(biāo)的水平，為缺血性腦卒中的防治提供更多的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 L-同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，辣根酶標(biāo)記抗人IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑購(gòu)自美國(guó)Epitomics 公司。J-26XP 超低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司);超低溫冰箱(MDF-U53V，三洋);PLUS 384 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(MDC 公司)。

1.2 研究對(duì)象 收集2012 年7 月～2012 年12 月入住北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)三療區(qū)患者的全血標(biāo)本。樣本總數(shù)共為111 例，其中男性患者65例，女性患者46 例;年齡34～82 歲，平均年齡62歲;其中75 人臨床診斷為缺血性腦卒中患者，36 人為正常體檢患者(作為正常對(duì)照組)。本研究通過北華大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，所有研究對(duì)象均已簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 正常組和缺血性腦卒中組患者血清的獲得 收集缺血性腦卒組及正常對(duì)照組人員的全血標(biāo)本，將試管置于試管架上靜置4 h 左右，置入高速離心機(jī)中，以3000 r/min 離心15 min，取上清分裝放入1.5 ml 離心管中，標(biāo)記后將所有標(biāo)本放入4 ℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗原制備 將0.2 mmol/L 同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯與10 mg/ml 人血白蛋白在pH 7.4，37 ℃的條件下配成作為抗原，4 ℃?zhèn)溆茫?］。

1.3.3 ELISA 法檢測(cè)患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體的表達(dá) 在96 孔酶標(biāo)板中加入100 μl 抗原，與包被液共同孵育，4 ℃冰箱過夜;次日棄上清，每孔加入200 μl 1%BSA，37 ℃培養(yǎng)1 h(每個(gè)樣本5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔)，PBST 洗滌后每孔加入100 μl 人血清置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜，用PBST 再次洗滌后加入100 μl(稀釋1∶ 10000)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG，37 ℃孵育1 h;顯色，濃硫酸終止反應(yīng);于自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm 處測(cè)定(A)值，用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 血清同型半胱氨酸與同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體水平 分析患者臨床Hcy 檢驗(yàn)提供數(shù)據(jù)顯示:腦卒中組患者血清中Hcy 水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。ELISA 結(jié)果顯示:腦卒中組患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)，見表1 所示。

2.2 血清生化指標(biāo)、葉酸和維生素B12水平血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示:腦卒中組患者甘油三酯、低密度脂蛋白和血糖呈升高趨勢(shì)，尤其是腦卒中組血糖值明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。而總膽固醇、高密度脂蛋白呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。腦卒中組患者的葉酸水平呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);腦卒中組的維生素B12升高，與正常對(duì)照組比較，差異亦沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。結(jié)果如表2 所示。

表1 血清中同型半胱氨酸與同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體水平

表2 血清中生化指標(biāo)水平

3 討論

腦卒中是臨床上的常見病和多發(fā)病。近年來，腦卒中的發(fā)病人群越來越年輕化。缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%，已嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。很多腦卒中患者并無傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素，但是在各種缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中同型半胱氨酸發(fā)揮了重要的作用，它是動(dòng)脈硬化性血管病發(fā)生的又一新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7，8］。因此，本實(shí)驗(yàn)分析了缺血性腦卒中患者血清Hcy 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn):缺血性腦卒中組患者的Hcy 水平明顯地高于對(duì)照組，這與Hcy 已被公認(rèn)為腦卒中危險(xiǎn)因素之一的結(jié)論是相符的。

Hcy 在體內(nèi)可以修飾蛋白質(zhì)，修飾方式主要有N-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯為代表)和S-同型半胱氨酸化(以同型半胱氨酸為代表)兩類。同型半胱氨酸化的蛋白質(zhì)在體內(nèi)會(huì)被識(shí)別為自身抗原，進(jìn)而引起自身免疫反應(yīng)，形成同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體，并在血管內(nèi)皮表面形成復(fù)合物，再進(jìn)一步損傷血管。當(dāng)上述這一反應(yīng)持續(xù)的、緩慢的發(fā)生，就會(huì)反復(fù)出現(xiàn)損傷-修復(fù)過程，最終損傷血管管壁，造成動(dòng)脈粥樣硬化引起腦卒中。在國(guó)外有用ELISA 法檢測(cè)長(zhǎng)期血液透析腎衰竭患者血中的同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體的水平［9］，但尚無腦卒中患者同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體水平的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)缺血性腦卒中患者血清中同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體水平，發(fā)現(xiàn)患者同型半胱氨酸水平明顯高于對(duì)照組。這說明缺血性腦卒中患者體內(nèi)高Hcy 水平導(dǎo)致了過多的同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體產(chǎn)生，這與腦卒中的發(fā)病可能有密切的關(guān)系。

除了Hcy 以外，血脂、血糖水平等都是引起腦卒中的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)也研究了這些傳統(tǒng)因素對(duì)腦卒中的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)腦卒中組患者甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖呈升高趨勢(shì)，血糖值則明顯升高。而高密度脂蛋白則呈下降趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)觀點(diǎn)保持了一致性。本實(shí)驗(yàn)也研究了腦卒中組患者血清中葉酸、維生素B12的水平，發(fā)現(xiàn)患者血中的葉酸水平呈下降趨勢(shì)，而維生素B12則升高。血液中蛋氨酸甲基化的過程需要葉酸和維生素B12作為輔基，因此，如果腦卒中的患者血中葉酸和維生素B12水平較低，患者血液的Hcy 就會(huì)有所升高，這與之前的研究結(jié)果相一致［9］。由此，我們可以認(rèn)為葉酸的攝入增加可降低腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但本實(shí)驗(yàn)中維生素B12結(jié)果與以往研究不同，還需要在以后更多病例的收集過程中，進(jìn)行更深入的研究。

由于Hcy 已被公認(rèn)為是腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，控制血清中Hcy 水平已成為預(yù)防和治療腦卒中疾病的新環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過分析證明了血中同型半胱氨酸化蛋白質(zhì)抗體、Hcy 水平與腦卒中發(fā)病的聯(lián)系以及傳統(tǒng)因素的變化。可為臨床腦卒中治療和研究提供依據(jù)。

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