JAK2 抑制劑AG490 對EAE 小鼠C57BL/6 的Th17/Treg 細胞平衡的影響

董 梅，王 彬，辛立建，郭 力，檀國軍，劉瑞春

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經系統炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，發病機制尚不完全清楚，考慮與遺傳、環境等多種因素有關，目前越來越多研究表明MS 發病可能與患者體內Th17/Treg 細胞失衡有關。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認的MS 經典模型，對MS 的發病機制、病程進展、診治方法等研究有重要的指導作用。近來研究發現MS/EAE 或許與Th17/Treg 失衡有關。

JAK-STAT 信號通路廣泛參與炎癥反應、腫瘤等多種生理、病理反應。JAK 是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，目前發現JAK 家族包括JAK1-3 及TYK2。STAT 即信號傳導及轉錄激活因子，磷酸化后進入細胞核內調節不同靶基因的轉錄。不同細胞因子激活不同的JAK 引起相應的STAT 磷酸化，從而調節特定基因對應產物的含量引起各種生物效應。JAK-STAT 信號通路同時參與了Th17 和Treg細胞分化的調節。

本研究應用JAK2 特異性抑制劑AG490 干預C57BL/6 小鼠EAE 模型，觀察EAE 小鼠脊髓組織病理變化及免疫組化染色IL-17、Foxp3+及p-STAT5表達情況。探討JAK2 抑制劑通過調控JAK-STAT信號通路，對Th17/Treg 平衡的影響和對EAE/MS的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

1.1.1 試 劑 MOG35-55 多肽購自西安霖肽生物科技有限公司，百日咳毒素購自ENZO 公司，AG490 購自Selleck 公司，FoxP3 抗體購自Immuno-Way 公司，p-STAT5 抗體購自bioworld 公司，IL-17抗體購自博士德公司。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6 小鼠60 只，體重18～22 g，6～8 周齡，購于河北醫科大學實驗動物中心(許可證號SCXK 冀2008-1-003)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將實驗動物隨機分為對照組、EAE 組和AG490 組。每組按時間點分為免疫后13 d 即發病初期組，免疫后20 d 即高峰期組，每個時間點動物各10 只。

1.2.2 動物模型建立與干預 以200 μl 磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解300 μg 人工合成MOG35-55 多肽，與等量含有4 mg/ml 卡介苗的完全弗氏佐劑(CFA)充分混合成為油包水乳劑，制備完全抗原，免疫小鼠。EAE 組和AG490 組均于免疫后第0 小時和48 h 于腹腔內注射百日咳毒素500 ng，制備EAE模型。直接將200 μl PBS 與等量CFA 乳化免疫動物作為對照組。干預時，于免疫后第3、5、7、9、11、13、15、17、19 天給予AG490 組小鼠AG490 1 mg 皮下注射至處死，生理鹽水0.1 ml/d 給予對照組和EAE 組小鼠皮下注射。免疫當天記為第0 天。

1.2.3 指標觀察 按實驗設計，各組動物于免疫后第13 天和第20 天取材，以水合氯醛麻醉小鼠至出現軟癱狀態，用生理鹽水沖洗左心室，之后用4%多聚甲醛灌注，取材后將脊髓組織固定于4%多聚甲醛，制備蠟塊，進行HE 染色及免疫組化染色，觀察炎癥、IL-17、Foxp3+及p-STAT5 表達情況。

1.2.4 統計學分析 采用SPSS13.0 統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差()表示，若數據不滿足正態性(P ＜0.05)則進行秩轉換，多組計量資料均數的比較應用ANOVA 方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法，P ＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床表現 小鼠免疫后逐漸出現精神萎靡、食欲下降、體重減輕，于免疫后12 d 開始出現尾部無力、肢體癱瘓和二便失禁等，AG490 組較EAE組小鼠發病率下降，發病時間延遲，癥狀減輕。

2.2 小鼠脊髓HE 染色 EAE 組小鼠發病初期可見少量“血管袖套”現象和大量淋巴細胞浸潤，發病高峰期可見到較多的“血管袖套”現象和更多的淋巴細胞浸潤，而AG490 組同時期炎癥均較EAE組減輕(見圖1)。

2.3 小鼠脊髓IL-17、Foxp3+及p-STAT5 表達情況 EAE 組小鼠脊髓發病高峰期較發病初期IL-17 陽性細胞數量增多(P ＜0.05)，p-STAT5 和Foxp3陽性細胞數目減少(P ＜0.05)。AG490 組小鼠脊髓IL-17 陽性細胞數目較同時期EAE 組小鼠減少(P ＜0.05)，p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數目增多(P ＜0.05，見表1～表3)。

表1 各組IL-17 陽性細胞數目比較()

表1 各組IL-17 陽性細胞數目比較()

高峰期與發病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

表2 各組Foxp3 陽性細胞數目比較()

表2 各組Foxp3 陽性細胞數目比較()

高峰期與發病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

表3 各組p-STAT5 陽性細胞數目比較()

表3 各組p-STAT5 陽性細胞數目比較()

高峰期與發病初期比較* P ＜0.05;AG490 組與EAE 組比較☆P ＜0.05;EAE 組、AG490 組與對照組比較#P ＜0.05

3 討論

Th17 細胞與包括MS、SLE、RA 在內的多種自身免疫性疾病有密切聯系。在MS 中Th17 細胞通過自身表達的趨化因子受體CCR6 與脈絡叢上皮細胞的趨化因子受體配體CCL20 相互作用從而透過脈絡叢進入蛛網膜下腔，進一步引起其他炎癥細胞聚集，釋放IL-17 在內的細胞因子從而引起相應炎癥介質釋放造成BBB 破壞、髓鞘脫失、軸索損傷等病理損害［1］。Th17 細胞是由初始CD4+T 細胞在IL-6和TGF-β 的共同作用下分化而來［2］，如果只存在TGF-β 而缺失IL-6，初始CD4+T 細胞則分化為Treg細胞［3］。維甲酸相關孤兒核受體γt(RORγt)以及RORα 屬于細胞內轉錄因子核受體家族中的成員，他們是Th17 重要的轉錄因子。由IL-6 在TGF-β 存在的前提下，通過IL-6R 募集并磷酸化JAK1、JAK2、Tyk2，磷酸化后的JAK2 把結合在IL-6R 上的STAT3磷酸化形成二聚體，進入細胞核調節靶基因上調RORγt，促進Th17 細胞形成以及IL-17 分泌。IL-17可以通過加強粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)和GM-CSF 受體增加嗜中性粒細胞、巨噬細胞等聚集。IL-17 還可以激活NF-κB、MAPK 信號通路加強促炎癥因子CXCL1、CXCL2、CXCL5 等合成［4］。此外IL-17 還能促進基質金屬蛋白(MMPs)的合成以幫助T 細胞降解胞外基質。

Treg 細胞是一類高表達IL-2 受體α 鏈(CD25)的CD4+T 細胞，在免疫應答的負調節及自身免疫耐受中發揮重要保護作用，此類細胞功能障礙可導致自MS 在內的多種自身免疫性疾病、代謝性疾病、過敏性疾病等異常。叉頭蛋白3(Foxp3)不僅是Treg細胞重要的標志，同時也參與Treg 的分化及功能。Foxp3 的功能缺失可以導致X 連鎖隱性自身免疫和炎性綜合征［5］。Treg 細胞主要包括從胸腺直接分化而來的自然調節T 細胞(nTreg)和在外周由初始CD4+T 細胞接受抗原及其他因素誘導產生的適應性調節T 細胞(iTreg)。它們的表型都是CD4+CD25+Foxp3+Treg，主要通過與靶細胞直接接觸及分泌TGF-β、IL-10、IL-35 細胞因子來抑制免疫應答。Treg 細胞主要通過細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4/CD152)影響CD80/CD86 介導的效應T 細胞及APC 與靶細胞接觸的抑制自身攻擊細胞［6］，而TGF-β、IL-10 主要通過抑制DC 來發揮免疫調節作用［5］。并且TGF-β 通過Smad 家族同時參與了Th17 和Treg 細胞分化調節。

JAK-STAT 信號通路廣泛參與CD4+T 細胞的分化，初始CD4+T 細胞在IFN-γ 和IL-12 作用下通過JAK1/JAK2-STAT1/STAT4 調控Th1 細胞分化，在IL-4 作用下通過STAT4/GATA3 調控Th2 細胞分化，在TGF-β 和IL-6 作用下通過JAK2/JAK1/Tyk2-STAT3 調控Th17 細胞分化，在TGF-β 和IL-2 作用下通過JAK1/JAK3-STAT5 調控Treg 細胞分化。AG490 是JAK2 特異性酪氨酸激酶抑制劑，并且不影響JAK1、Tyk2 的活性，被廣泛用于抑制JAK2 參與的 信 號 傳 導［7，8］，所 以AG490 主 要 通 過 抑 制JAK2-STAT3 信號通路影響Th17 細胞的分化和IL-17 的合成，由于調節Treg 細胞分化功能的主要是JAK1/JAK3-STAT5 信號通路以及Smad 蛋白家族，所以AG490 并不影響CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞分化和功能，故本實驗應用AG490 腹腔注射于小鼠EAE 模型來觀察小鼠炎癥反應情況及JAK2 抑制劑對Th17/Treg 細胞平衡的影響情況。

由于STAT3 不僅對Th17 分化起重要作用，同時也參與Treg 分化的調節［9］，而IL-17 和EAE 的進展具有直接關系，所以，我們將IL-17 作為Th17 數量和功能的觀察指標。可以看到隨著小鼠EAE 模型發病，EAE 組小鼠逐漸表現出食欲減低、精神萎靡、尾部無力等臨床癥狀，并且HE 染色可以觀察到小鼠脊髓組織內淋巴細胞浸潤增多，“血管袖套”現象逐漸明顯，而此時IHC 觀察到小鼠脊髓內IL-17陽性細胞數增多，說明逐漸增多的Th17 細胞和IL-17 導致小鼠病情的進展，在AG490 組小鼠中也可以看到隨著時間推移，IL-17 陽性細胞數目的增多，但在與EAE 組相對應時期的小鼠相比IL-17 陽性細胞數目相比較少，這也與AG490 組小鼠臨床癥狀相對較輕符合，這說明AG490 抑制了Th17 細胞的分化和功能。

Th17 細胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞分化和功能在多個水平上相互抑制拮抗，Smad7 對Foxp3表達具有抑制作用，IL-6R 可以通過增加Smad7 的表達來抑制TGF-β 引起的Foxp3 表達［10］，此外ROR-γt 和Foxp3 也具有互相抑制作用［11］，STAT3和STAT5 由于都具有SH2 結構域也可以相互競爭結合位點，所以Th17 在許多層面上都對Treg 具有抑制作用，這或許可以解釋為什么當TGF-β 單獨存在是初始CD4+T 細胞向Treg 方向分化，而當TGFβ 和IL-6 同時存在時則初始CD4+T 細胞向Th17 方向分化。故當我們用JAK2 抑制劑AG490 抑制IL-6-JAK2-STAT3 的信號傳導后不僅可以抑制Th17 細胞分化和IL-17 合成，而且通過減小Th17 對Treg 的抑制可以促進CD4+CD25+Foxp3+Treg 分化。由于CD4+CD25+Foxp3+Treg 不僅釋放抗炎介質而且還能與炎癥細胞相互接觸來發揮抗炎作用，TGF-β 不僅促進CD4+CD25+Foxp3+Treg 分化，也對通過Smad 蛋白對Th17 細胞分化起重要作用，IL-10 則不僅具有抗炎作用也可以發揮促進炎癥反應的作用［12］，但基本nTreg 和iTreg 都表達Foxp3，并且Foxp3 也對CD4+CD25+Foxp3+Treg 的功能發揮起作用，所以我們將p-STAT5 和Foxp3 作為衡量CD4+CD25+Foxp3+Treg 數量和功能的指標。可以看到不論EAE 組還是AG490 組發病高峰期與發病初期相比，高峰期p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數量都有一定程度減少，這說明隨著EAE 病情發展，Th17 逐漸增多對CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的抑制作用也逐漸加強，Th17/Treg 平衡偏向Th17 細胞導致炎癥反應加強。但同一時期AG490 組小鼠脊髓p-STAT5 和Foxp3 陽性細胞數比EAE 組小鼠脊髓明顯增多，這與AG490 組小鼠炎癥細胞浸潤相對較少及“血管袖套”現象不如EAE 組小鼠明顯相一致，說明AG490 雖然沒有完全阻止EAE 發病，但很大程度上抑制了Th17 細胞的功能促使Th17/Treg平衡偏向Treg 方向，并減緩EAE 小鼠炎癥反應。

總之，AG490 作為一種JAK2 特異性抑制劑緩解了EAE 小鼠的炎癥反應，調整Th17/Treg 的方向，顯示出了對MS 患者的潛在治療價值，并且SOCS1 和SOCS3 具有相似的作用，都可以與通過抑制JAK2 磷酸化發揮調節作用［13］，同時由于Treg 調節免疫反應參與MS 在內的多種自身免疫性疾病，預示著與通過干預JAK2-STAT3-SOCS 信號通路來調節Th17/Treg 平衡或許可以成為MS 等自身免疫性疾病一個新的治療方向。

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圖1 各組小鼠不同發病時期脊髓HE 染色(HE，×400)