二十二碳六烯酸預處理增強大鼠腦膠質細胞對氧糖剝奪條件下腦血管內皮細胞的保護作用

陳小波，占樂云，王 強，舒愛華，張明瑜，鄧彩英

神經科學的研究表明，神經元細胞、膠質細胞和血管內皮細胞共同組成了一個完整的神經功能單元，它們之間相互的信號聯系與血腦屏障功能的完整密切相關［1，2］。研究證實，膠質細胞和管周細胞等以旁分泌作用的方式分泌血管生成素1(Ang1)，并激活血管內皮細胞Tie2 受體、調控其下游的抗凋亡等信號通路［3］。在我們前期的研究中發現，DHA預處理能夠明顯上調膠質細胞在氧糖剝奪環境下Ang1 的分泌。由于DHA 能夠經多靶調節機制發揮腦保護作用，因此初步推測DHA 可能通過上調缺血環境下膠質細胞Ang1 的分泌水平，產生對血管內皮細胞的保護作用，并維持血腦屏障的完整性。我們希望為進一步探討DHA 的腦保護作用機制提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 Nu47-E 可調氧濃度孵箱(Nuaire，美國)、流式細胞儀(BD Biosciences)、TCSSP5 激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)。兔抗大鼠vWF 多克隆抗體(Chemicon，美國);Bax、bcl-2(cell signaling);capase-3 (Santa Cruz 公司);ZO-1、HRP 標記羊抗小鼠二抗、HRP 標記羊抗兔二抗、HRP 標記兔抗羊二抗(武漢博士德生物工程有限司);P-tie2(MILYPORE);顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物);細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物)。

1.2 腦星形膠質細胞和BMECs 的分離與培養取2～3 w SD 大鼠，雌雄均可，體重40～60 g (華中科技大學實驗動物中心)，按照文獻中描述的方法分別分離、培養和純化腦星形膠質細胞和BMVECs。第3 代細胞95%以上為BMECs，用于實驗。

1.3 氧糖剝奪模型(OGD)的建立 將原代培養的兩種細胞在5% CO2條件下培養24 h 使細胞同步化。然后用無糖、無血清的DMEM 液置換原培液，再經94% N2∶ 5% CO2∶ 1% O2低氧條件下培養24 h。

1.4 腦星形膠質細胞培養的上清液 腦膠質細胞隨機分為正常對照組(Ⅰ)、OGD 組(Ⅱ)、10 μmol DHA 預處理組(Ⅲ)、40 μmol DHA 預處理組(Ⅳ)。在正常對照組加入含血清和葡萄糖的DMEM，OGD 組和DHA 預處理組為無糖、無血清的DMEM。DHA 組另加入兩種濃度的DHA 后在5%CO2和95%空氣條件預處理培養1 h。除正常對照組在5% CO2和95%空氣條件下培養外，其余組94% N2∶ 5%CO2∶ 1% O2條件下培養，所有組培養時間為24 h。收集各組培養后的上清液。

1.5 BMECs 和腦星形膠質細胞培養的上清液共培養 將血管內皮細胞隨機分為正常對照+培養上清液Ⅰ(A 組)、OGD+培養上清液Ⅱ(B 組)、OGD+培養上清液Ⅲ(C 組)、OGD +培養上清液Ⅳ(D 組)、OGD+sTie2Fc+培養上清液Ⅲ(E 組)、OGD+sTie2Fc+培養上清液Ⅳ(F 組)，每組設3 個復孔。各組先培養24 h 使細胞同步化。然后置換原培養液:在A 組加入2/3 量的含血清、和葡萄糖DMEM 和1/3 量的培養上清液Ⅰ;B 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養上清液Ⅱ;C 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3量的培養上清液Ⅲ;D 組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養上清液Ⅳ;E 組加入2/3量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養上清液Ⅲ及10 μg/ml sTie2Fc;F 組組加入2/3 量的無糖、無血清的DMEM 和1/3 量的培養上清液Ⅳ及10 μg/ml sTie2Fc。除正常對照組在5%CO2和95%空氣條件下培養外，其余組94%N2∶ 5%CO2∶ 1%O2培養，培養時間均為24 h。

1.6 細胞凋亡實驗 用不含EDTA 的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集，1500 rpm，5 min 離心，去上清，加PBS 重懸;用PBS 將細胞潤洗兩次，1500 rpm，5 min，按照AnnexinV＆PI 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行:各樣品分別加入500 μl Binding Buffer，5 μl AnnexinV，5 μl PI，混勻，室溫避光反應5～15 min(同時設陰性對照，即正常細胞不加AnnexinV 和PI;陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl AnnexinV 單標;陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5 μl PI 單標)流式細胞儀上機檢測以上實驗均重復3 次并進行統計學分析。

1.7 Western blotting 法 檢 測 Bax、bcl-2、caspase-3 等總蛋白 取適量RIPA 裂解液裂解細胞，測蛋白濃度后，各樣品取50 μg 總蛋白上樣電泳，根據蛋白分子量配制8%的PAGE 膠電泳。根據預染Marker 顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。取出凝膠根據Marker 切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，剪與PAGE 凝膠相同大小的PVDF 膜和濾紙，PVDF 膜用甲醇浸泡數秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF 膜，室溫搖床封閉2 h。TBST 充分洗滌PVDF 膜5～6 次，5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP 標記二抗-1 ∶ 50000 稀釋，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h。TBST 充分洗滌PVDF 膜5～6 次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL 底物液，孵育數分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X 光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。實驗重復3 次，用Band Scan 分析膠片目的蛋白和內參照條帶的灰度值，將目的條帶的灰度值與同一樣本內參照的灰度值相比，得出目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0 軟件分析。計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析和SNK，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質細胞培養24 h 后的上清液Ang1 含量 與正常對照組比較(1279.33 ±16.27)pg/ml，OGD 組Ang1 分泌量明顯降低(1073.67 ±24.55)pg/ml (P ＜0.01)，OGD+40 μmol DHA 組有明顯增加(1758.01 ±33.18)pg/ml (P ＜0.01)，但OGD +10 μmol DHA 組Ang1 分泌量無差異(1363.33.01 ±28.94)pg/ml P ＞0.05);與OGD 組比較，OGD +10 μmol DHA 組 和OGD+40 μmol DHA 組Ang1 分泌量均明顯增加(P ＜0.01);與OGD +10 μmol DHA組比較，OGD +40 μ mol DHA 組有明顯差異(P ＜0.01)。

2.2 腦血管內皮細胞凋亡的影響 與A 組比較，其余各組腦血管內皮細胞凋亡均明顯增加(P ＜0.01);與B 組比較，C 和D 兩組細胞凋亡明顯降低(P ＞0.01)，與B 組比較，E 組和F 組細胞凋亡也有明顯差異(P ＜0.01);但與C 組比較，E 組細胞凋亡明顯增加(P ＜0.01);與D 組比較，F 組細胞凋亡明顯增加(P ＞0.01)(見圖1)。

2.3 Bax、bcl-2、caspase-3 等蛋白表達 Western blotting 結果顯示，各組之間內參蛋白β-actin 表達無差異(P ＞0.05);與A 組比較，其余各組Bax、caspase-3 表達明顯增加(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達明顯降低(P ＜0.01);與B 組比較，C 和D 兩組細胞Bax、caspase-3 表達明顯降低(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達明顯增加(P ＜0.01);與B 組比較，E 組和F 組Bax、caspase-3 有明顯降低(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達明顯增加(P ＜0.01);與C 組比較，E 組細胞Bax、caspase-3 表達明顯增加(P ＜0.01)，bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達明顯降低(P ＜0.01);與D 組比較，F 組細胞組Bax、caspase-3、bcl-2、bcl-2/Bax、pTie-2、pAkt、ZO-1 表達均有明顯降低(P ＜0.01)(見表1、表2)。

2.4 Western blotting 化學發光免疫印跡圖各組Bax、bcl-2、caspase-3 和β-actin 等蛋白Western blotting 化學發光免疫印跡圖(見圖2)。

表1 Western blotting 檢測caspase-3、bax、bcl-2、bcl-2/bax 的表達(n=3，)

表1 Western blotting 檢測caspase-3、bax、bcl-2、bcl-2/bax 的表達(n=3，)

與A 組比較* P ＜0.01;與B 組比較#P ＜0.01;與C 組比較△P ＜0.01;與D 組比較▽P ＜0.01

表2 Western blotting 檢測p-tie2、P-Akt-2、ZO-1的表達(n=3，)

表2 Western blotting 檢測p-tie2、P-Akt-2、ZO-1的表達(n=3，)

與A 組比較* P ＜0.01;與B 組比較#P ＜0.01;與C 組比較△P＜0.01;與D 組比較▽P ＜0.01

圖1 腦血管膠質細胞凋亡流式分析結果

圖2 A 組:正常對照+培養上清液Ⅰ;B 組:OGD+培養上清液Ⅱ;C 組:OGD+培養上清液Ⅲ;D 組:OGD+培養上清液Ⅳ;E 組:OGD+培養上清液Ⅲ+sTie2Fc;F 組:OGD+培養上清液Ⅳ+sTie2Fc

3 討論

我們的研究結論表明:經DHA 預處理后的膠質細胞，并在體外模擬缺血/缺氧環境下培養24 h 后，其上清液中Ang1 的含量明顯增加。當將其上清液加入到同樣缺氧環境下培養的腦血管內皮細胞中，后者的凋亡出現明顯降低。已有其它研究證實，低氧條件下培養的腦星形膠質細胞能夠分泌GDNF 與TGF-β1［4］，對同樣缺氧環境下培養的腦神經元細胞等產生保護作用，但是Ang1 并不參與這種保護作用機制［5］。其原因可能是在低氧環境下星形膠質細胞Ang1 mRNA 和Ang1 分泌水平發生明顯下降［6］。在本實驗中也同樣發現，未經DHA 預處理的膠質細胞Ang1 分泌水平與正常氧含量條件下比較有明顯降低。Ang1 是Tie-2 的配體，Tie-2 激活后經PI3/Akt信號通路發揮抗凋亡作用［7］。表現為促凋亡蛋白Bax 等水平下降，而抗凋亡蛋白bcl-2 生成增加［8］。在研究中發現，經DHA 預處理的膠質細胞在低氧環境下培養上清液，使血管內皮細胞Tie-2 受體的磷酸化水平及其下有信號通路PI3/Akt 激活水平明顯增加。當加入抑制劑(sTie2Fc)后，細胞凋亡和Bax 水平明顯增加，而抗凋亡蛋白bcl-2 生成明顯降低。這些結果進一步說明，其保護機制可能與Ang1 激活Tie-2 明顯相關。

研究結果還表明:經DHA 預處理的膠質細胞在缺氧環境下培養后的上清液，能夠使血管內皮細胞ZO-1 蛋白表達增加。ZO-1 蛋白對于維持血腦屏障的完整性具有重要的作用［9，10］。當加入抑制劑后，與相應未加抑制劑組比較，ZO-1 蛋白的表達明顯下降。但研究結果還發現，加入抑制劑并不能完全消除使ZO-1 蛋白的表達上調的作用，這些研究說明上調ZO-1 蛋白表達的機制，可能大部分作用與Ang1激活Tie-2 受體相關，同時也可能還有其它作用機制參與。

綜上所述，DHA 預處理后的星形膠質細胞能夠增強對氧糖剝奪環境下大鼠腦微血管內皮細胞的保護作用，其機制可能與上調Ang1 的表達，激活Tie-2受體后，經PI3/Akt 等下游信號通路作用相關。

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