丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后微血管密度丙二醛、超氧化物歧化酶的影響

朱 江，竇志杰，丁 萌，張玉坤，張 杰，高蘭英

腦組織慢性低灌注狀態(tài)可造成缺血缺氧，產(chǎn)生大量自由基攻擊線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)受損功能亦發(fā)生相應(yīng)改變，出現(xiàn)呼吸鏈的電子傳遞鏈發(fā)生障礙、ATP 合成下降、能量代謝障礙、葡萄糖利用減少、蛋白質(zhì)合成異常、血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失、神經(jīng)元壞死和凋亡［1］。目前認(rèn)為腦組織缺血后自由基增多是腦損傷加重的主要原因［2］，而超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等是反映氧自由基水平的主要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后微血管密度、SOD、MDA 水平的影響，探討丁苯酞氯化鈉注射液清除自由基的有關(guān)機(jī)制及對延髓缺血后的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF 級Wistar 成年健康雄性大鼠，220～260 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。60 只大鼠隨機(jī)分為3 組:假手術(shù)組、治療組、缺血對照組。其中假手術(shù)組每組6 只大鼠，其余按時(shí)間點(diǎn)分為7 d、14 d 兩個(gè)亞組，每組12 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側(cè)頸總動脈并結(jié)扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物的干預(yù)方法 假手術(shù)組只暴露雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側(cè)椎動脈及右側(cè)頸總動脈后立即開始治療。治療組每天腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液兩次，時(shí)間間隔12 h，每次注射計(jì)量按3 mg/kg 計(jì)算，到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時(shí)間間隔12 h，每次注射計(jì)量為0.5 ml/次。到術(shù)后7 d 和14 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死，取延髓。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制作 將大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，麻醉后快速斷頭法處死，在冰盤上快速取延髓，置于0 ℃～4 ℃生理鹽水中漂洗，清除血液，濾紙拭干。每個(gè)亞組中6 只腦組織用于單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度，另外6 只腦組織放入9 倍量的0 ℃～4 ℃生理鹽水中，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10%腦勻漿，用離心機(jī)3500 r/min，離心15 min，取上清液分3 份置于-20 ℃保存，用于測定SOD、MDA 含量。

1.2.4 觀察指標(biāo) (1)腦組織中SOD、MDA 含量測定。延髓中SOD、MDA 含量:SOD 含量采用黃嘌呤氧化酶法測定。MDA 含量采用硫代巴比妥酸TBA)比色法測定。(2)單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度:每只大鼠取3 張切片，采用Simple PCI-8 圖像分析軟件分析腦組織微血管灰度。每張切片在光鏡下選5 個(gè)視野，取平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該分析儀器的灰度級為0～256 灰級，平均灰度表示陽性細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，平均灰級越高，說明反應(yīng)強(qiáng)度越低。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 14.0 進(jìn)行分析，采用t 檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織大體變化 延髓缺血后水腫于7 d明顯，14 d 時(shí)有所減輕。治療組各時(shí)間段腦組織腫脹程度與缺血對照組相比均減輕。

2.2 各組腦組織中SOD、MDA 含量比較 與假手術(shù)組相比，治療組、缺血對照組SOD 均減少;治療組與缺血對照組相比較，治療組SOD 含量升高。缺血對照組MDA 含量較高;治療組的MDA 含量較缺血對照組減低(見表1、表2)。

2.3 各組腦組織中微血管灰度的變化 通過對7 d、14 d 后實(shí)驗(yàn)動物的觀察，治療組及缺血對照組的微血管灰度值較假手術(shù)組均增加。治療組數(shù)值增加的幅度低于缺血對照組。其中，治療組微血管灰度值在各時(shí)段均低于缺血對照組。與假手術(shù)組相比較二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3)。

表1 各組大鼠腦組織中SOD 含量的比較(，n=6)

表1 各組大鼠腦組織中SOD 含量的比較(，n=6)

與假手術(shù)組相比#P ＜0.05;與缺血對照組相比* P ＜0.01

表2 各組大鼠腦組織中MDA 含量的比較(，n=6)

表2 各組大鼠腦組織中MDA 含量的比較(，n=6)

假手術(shù)組相比#P ＜0.05;與缺血對照組相比* P ＜0.01

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較(，n=6)

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較(，n=6)

與假手術(shù)組相比#P ＜0.05;與缺血對照組相比* P ＜0.01

3 討論

腦組織缺血后出現(xiàn)細(xì)胞水腫、興奮性氨基酸產(chǎn)生增加、Ca2+內(nèi)流增加。細(xì)胞水腫線直接導(dǎo)致腦組織的占位效應(yīng)，更為嚴(yán)重的是大量自由基級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧，活性氧與包括神經(jīng)元、微血管細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)元單元各種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)破壞、細(xì)胞膜降解［3～5］。在正常情況下機(jī)體內(nèi)氧自由基含量很少，其中內(nèi)源性自由基清除劑發(fā)揮重要作用［6］。SOD 作為內(nèi)源性氧自由基清除劑，是一種金屬蛋白酶，可保護(hù)生物體免受自由基的影響［7］。SOD 含量在一定程度上間接反映內(nèi)源性氧自由基清除能力。MDA 是膜脂質(zhì)降解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，用來反映脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)，其含量的變化間接反應(yīng)組織中氧自由基含量的變化［8］。丁苯酞氯化鈉注射液可保護(hù)缺血腦組織和改善腦能量代謝，抑制自由基的產(chǎn)生［9～11］，抑制Ca2+超載，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，也能防止氧化性細(xì)胞損傷，減少缺血半暗帶面積，可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損害［12，13］。

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，缺血7 d 延髓水腫程度顯著升高。丁苯酞氯化鈉注射液治療組延髓組織水腫程度較缺血對照組明顯降低。丁苯酞氯化鈉注射液可能通過抑制氧自由基生成，有效控制細(xì)胞通透性變化，減輕缺血造成的延髓組織水腫。治療組SOD水平7 d 明顯高于缺血對照組，各時(shí)間點(diǎn)MDA 水平均明顯低于缺血對照組。說明丁苯酞氯化鈉注射液在延髓缺血過程中通過清除自由基，減輕了腦組織損傷。SOD 水平在延髓缺血7 d 時(shí)明顯高于缺血對照組，而在延髓缺血14 d 時(shí)出現(xiàn)下降，提示丁苯酞氯化鈉注射液對自由基的清除效果于缺血7 d 時(shí)明顯，之后藥物作用減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比較，治療組微血管灰度值增加的程度明顯低于缺血對照組。因丁苯酞氯化鈉注射液減輕自由基對內(nèi)源性SOD 的消耗，同時(shí)有效地減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，微血管密度增加可從根本途徑上改善腦組織缺血造成的損傷。但隨著延髓缺血時(shí)間的延長，自由基產(chǎn)生的增加，SOD 在數(shù)量上會減少，提示在治療上應(yīng)盡早用藥干預(yù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，延髓缺血后由于自由基產(chǎn)生，使缺血腦組織損傷加重，丁苯酞氯化鈉注射液通過清除自由基，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，發(fā)揮了對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

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