乙酰唑胺對慢性癲癇大鼠海馬NF-κB p65、IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達(dá)的影響

余 涵 ，陳 麗，馬 猛，周玉波，王林杰，羅亞楠，朱曉琴，雷水生

癲癇(Epilepsy)是一種常見的以腦部神經(jīng)元同步化異常放電所致的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性臨床綜合征，其中約有30%～40%的癲癇為藥物難以控制的頑固性癲癇［1］。IL-1β、IL-6 和TNF-α 是具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。大量臨床和基礎(chǔ)研究顯示，細(xì)胞因子參與慢性癲癇的發(fā)病過程［2］。AQP4 是腦內(nèi)與水的通透性有關(guān)的最重要的轉(zhuǎn)運蛋白，并與癲癇發(fā)病的電生理學(xué)機制及難治性癲癇腦損傷機制等密切相關(guān)［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)AQP4 缺失可以明顯減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)［4］，提示AQP4 表達(dá)可能參與炎性因子的調(diào)控作用，然而在癲癇發(fā)作過程中AQP4 與炎性因子的關(guān)系不明確，本課題組前期研究已證實乙酰唑胺能通過抑制AQP4 的表達(dá)從而抑制癲癇發(fā)作(文章已錄用)，因此本研究采用AQP4 抑制劑乙酰唑胺抑制AQP4 的表達(dá)，旨在探討在慢性癲癇發(fā)作過程中AQP4 與炎性因子間的調(diào)控關(guān)系以及乙酰唑胺抑制癲癇發(fā)作的其它可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 乙酰唑胺購自Sigma公司;戊四氮購自Sigma 公司;Trizol 購自Invitrogen公司;引物合成由上海Invitrogen 生物工程公司完成;RT-qPCR 試劑盒購自Takara 公司;ELISA 試劑盒購自深圳欣博盛公司;NF-κB p65 購于Abcam 公司;二抗購自北京中杉金橋公司;ECL 發(fā)光液購自凱基生物技術(shù)公司。

1.2 實驗分組 選用成年健康(Sprague-Dawley，SD)大鼠(廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重(240 ±30)g，雌雄不拘，實驗室常規(guī)條件下喂養(yǎng)。按實驗要求隨機分為3 組:對照組、致癇組、乙酰唑胺干預(yù)組。

1.3 慢性動物模型制備及評定標(biāo)準(zhǔn) 體重為(240 ±30)g 成年SD 大鼠50 只，(1)對照組(n=10)腹腔注射等量生理鹽水;(2)致癇組(n=20)腹腔注射戊四氮亞劑量35 mg/kg;(3)乙酰唑胺干預(yù)組(n=20)腹腔注射乙酰唑胺35 mg/kg，30 min 后再注射上述劑量PTZ，連續(xù)注射28 d。每次注射均在上午8:00～10:00 進(jìn)行。每次注射后1 h 內(nèi)觀察并記錄癇性發(fā)作潛伏期和發(fā)作強度等行為學(xué)變化。癲癇發(fā)作強度按Racine 癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)評價［5］:0 級:無抽搐反應(yīng);Ⅰ級:口周及面部肌肉抽搐;Ⅱ級:節(jié)律性點頭樣發(fā)作或甩尾;Ⅲ級:頭部抽搐及前肢陣攣發(fā)作;Ⅳ級:直立，全身強直陣攣發(fā)作;Ⅴ級:驚厥致摔倒，全身強直陣攣發(fā)作伴失張力發(fā)作。凡至少連續(xù)出現(xiàn)5 d Ⅱ級以上的發(fā)作即認(rèn)為慢性點燃成功［6］。

1.4 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá) 稱取50 mg 海馬，溶于500 μlTrizol，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;β-actin 的引物序列:上游5'-GGAGATTACTGCCCGGCTCCTA-3’，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’，擴增片段長度為150 bp。IL-1β 的引物序列:上游5'-CTGTACTCGTGGGATGATG-3’，下游5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3’，擴增片段長度為210 bp。IL-6的引物序列:上游5'-CAGTTGCCTTCTTGGGACT -3’，下游5'-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3’，擴增片段長度為224 bp。TNF-α 的引物序列:上游5'-AGATGTGGAACTGGCAGAGG-3’，下游5'-GAGCCCATTTGGGAACTTCT -3’，擴增片段長度為181 bp。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40 個循環(huán);95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。實驗數(shù)據(jù)使用IL-1β、IL-6、TNF-α 和β-actin RNA 循環(huán)閾值(Ct)之差(△Ct)計算得到相關(guān)基因的表達(dá)情況。計算對比的樣本間基因表達(dá)的差異(△△Ct)，表達(dá)差異的倍數(shù)RQ 為2-△△Ct，以對照組的RQ 值為1，各組是相對于1 的變化倍數(shù)。

1.5 免疫蛋白印跡(Western blot)檢測NF-κB p65 蛋白表達(dá) 取50 mg 海馬組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。蛋白定量后，以40 μg/孔上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE 垂直電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入NF-κB p65兔抗大鼠單克隆抗體(1∶ 2000)和β-actin 兔抗大鼠單克隆抗體(1∶ 2000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶ 5000)室溫孵育1 h，ECL顯色利用Gene Gnome 成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶。使用Image-J 軟件測定各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化NF-κB p65 蛋白的表達(dá)水平。

1.6 ELISA 檢測海馬和血清內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá) 取50 mg 海馬組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。IL-1β、IL-6、TNF-α 含量嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，以空白調(diào)零，450 nm 波長下檢測光密度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.001為差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察 戊四氮注射后，首先為I 級發(fā)作，表現(xiàn)為全身顫抖、豎毛、嘴和面部肌肉抽搐反應(yīng)，隨著用藥時間的延長，癲癇發(fā)作程度也加重，從活動減少、咀嚼、節(jié)律性點頭(Ⅱ級)到頭頸上仰、前肢陣攣發(fā)作(Ⅲ級)甚至出現(xiàn)明顯出現(xiàn)直立豎尾、以尾拍擊地面、全身強直陣攣發(fā)作甚至直立并摔倒(Ⅳ、Ⅴ級)。對照組未見癲癇發(fā)作。

2.2 海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá) RT-qPCR 結(jié)果顯示腦組織IL-1β、IL-6、TNFα mRNA 的表達(dá):致癇組均顯著高于對照組和乙酰唑胺干預(yù)組(P ＜0.001 或P ＜0.05);乙酰唑胺干預(yù)組IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)有所下降但仍高于對照組(P ＜0.05)(見表1)。

2.3 海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的表達(dá) ELISA 結(jié)果顯示腦組織IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白的表達(dá)變化:IL-1β、IL-6 和TNF-α 在對照組中也有表達(dá)，致癇組中的含量顯著高于對照組(P ＜0.001);癲癇模型大鼠用乙酰唑胺處理后IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的含量低于致癇組(P ＜0.05)，但仍高于對照組(P ＜0.05)(見表2)。

2.4 Western blot 檢測各組NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況 Western blot 結(jié)果顯示:NF-κB/p65 蛋白在各組表達(dá)相對灰度值比值分別為(0.2192 ±0.0254)、(0.4741 ±0.0206)、(0.3561 ±0.0229)。致癇組與對照組相比NF-κB p65 蛋白表達(dá)量顯著增加(P ＜0.001)，致癇組NF-κB p65 蛋白表達(dá)要高于乙酰唑胺干預(yù)組(P ＜0.05)，乙酰唑胺干預(yù)組與對照組相比明顯降低(P ＜0.05)(見圖1)。

表1 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá)()

表1 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá)()

致癇組、乙酰唑胺干預(yù)組與對照組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.001;乙酰唑胺干預(yù)組與致癇組比較#P ＜0.05

表2 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白的含量()(pg/ml)

表2 大鼠海馬組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白的含量()(pg/ml)

致癇組、乙酰唑胺干預(yù)組與對照組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.001;乙酰唑胺干預(yù)組與致癇組比較#P ＜0.05

圖1 Western blot 檢測NF-κB p65 蛋白在大鼠海馬組織中的表達(dá)

3 討論

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)失衡是癲癇發(fā)病的重要原因［7］。大量臨床和基礎(chǔ)研究也證實，炎性因子與炎癥反應(yīng)參與了癲癇的發(fā)病過程［8，9］。本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠側(cè)腦室注射IL-1β 出現(xiàn)中度癲癇發(fā)作［10］。Gomez 等［11］發(fā)現(xiàn)藥物長春西汀和卡馬西平抗癲癇作用可能與減少大鼠海馬內(nèi)炎性因子IL-1β、TNF-α 表達(dá)有關(guān)。慢性癲癇反復(fù)發(fā)作致使腦內(nèi)炎癥持續(xù)性存在，腦組織發(fā)生病理改變，特別是腦內(nèi)對癲癇發(fā)作敏感區(qū)域如海馬等。

NF-κB 以二聚體的形式存在，是體內(nèi)重要的信號調(diào)控蛋白。NF-κB 能通過與免疫球蛋白κ 輕鏈基因的增強子κB 序列特異性的結(jié)合，參與多種炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，并與細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放有關(guān)［12］。p50/p65 異源二聚體是該家族成員中發(fā)揮主要作用的因子，廣泛存在于神經(jīng)元中。Crespel［13］利用合并海馬硬化的顳葉癲癇患者術(shù)后病理切片進(jìn)行免疫組化發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞和大腦錐體細(xì)胞NF-κB p65 過度表達(dá)，并推測癲癇形成過程可能是由NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程。研究表明NFκB 信號通路參與了神經(jīng)元興奮和神經(jīng)膠質(zhì)疤痕的形成、神經(jīng)元的調(diào)亡及突觸可塑性變化等，過度激活將引起機體的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)癲癇發(fā)作［14］。

AQP4 在正常腦組織中呈極性分布，主要表達(dá)在血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞終末足突，而靠近神經(jīng)元側(cè)的終末足突表達(dá)較少［15］，在腦脊液的形成與吸收、滲透壓調(diào)節(jié)、腦水腫形成等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［16］。顳葉癲癇致海馬硬化的患者手術(shù)所取的海馬標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)AQP4 mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯增加［17］。最近有研究顯示AQP4 缺失可以明顯減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，AQP4 敲除小鼠可降低炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)［18］。大量研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過釋放炎性因子，直接改變神經(jīng)元的興奮性［19］，這些研究提示AQP4與炎性因子表達(dá)可能有密切聯(lián)系。

本課題組前期在戊四氮誘導(dǎo)慢性致癇大鼠中應(yīng)用乙酰唑胺，發(fā)現(xiàn)能夠抑制AQP4 的表達(dá)，并且延長了慢性癲癇點燃潛伏期，具有抑制癲癇發(fā)作的效應(yīng)。在本實驗中RT-qPCR 以及ELISA 結(jié)果顯示大鼠海馬組織以及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 在致癇組的表達(dá)均明顯高于對照組(P ＜0.001);Western blot 結(jié)果顯示海馬NF-κB p65 含量與對照組相比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。本研究中戊四氮誘導(dǎo)大鼠慢性癲癇發(fā)作后，海馬組織勻漿液中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平均升高，表明免疫細(xì)胞處于活化狀態(tài)。本實驗中RT-qPCR 和ELISA 結(jié)果顯示乙酰唑胺干預(yù)組IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)量與致癇組相比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，但依然高于對照組(P ＜0.05)。同樣Western blot 結(jié)果顯示乙酰唑胺干預(yù)組AQP4 和NF-κB p65 的表達(dá)量與慢性致癇組相比也降低，但依然高于對照組(P ＜0.05)。我們觀察到用乙酰唑胺預(yù)處理后，海馬促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)量以及NF-κB p65 也下降。表明AQP4 的選擇性抑制劑乙酰唑胺也能夠抑制NF-κB 信號傳導(dǎo)通路激活，使NF-κB p65 的活化程度下降，其下游所調(diào)控的IL-1β、TNF-α等炎癥基因的轉(zhuǎn)錄下降，相應(yīng)因子合成減少，炎癥反應(yīng)減輕，而在待發(fā)表的文章中我們已證實AQP4 選擇性抑制劑乙酰唑胺預(yù)處理后能夠明顯延長戊四氮致慢性癲癇大鼠發(fā)作潛伏期。因此乙酰唑胺可能通過減輕炎癥反應(yīng)抑制癲癇發(fā)作。

結(jié)合前期研究，戊四氮致癇后AQP4 表達(dá)增加，而AQP4 與腦內(nèi)水平衡維持密切相關(guān)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)間過多的水經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP4 通道及時的轉(zhuǎn)運到血管前區(qū)域，以維持神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞間正常的間隙和滲透壓。癲癇發(fā)作后靠近神經(jīng)元一側(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸上AQP4 表達(dá)增加，而靠近血管前一側(cè)表達(dá)量減少，使得水在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)間的轉(zhuǎn)運紊亂，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫性損傷。AQP4 選擇性抑制劑能夠抑制AQP4 和炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制癲癇發(fā)作。其機制可能與乙酰唑胺抑制AQP4 表達(dá)、改善星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫損傷、減輕炎性因子的表達(dá)有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉能夠增強炎性因子及星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上AQP4 的表達(dá)［20］。Ito［21］等人研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)側(cè)腦室穿刺注射IL-1β 后能夠引起AQP4 的表達(dá)上調(diào)。既往研究表明炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 在癲癇發(fā)作后6 h 快速升高［22］，并且大量研究表明慢性炎性因子持續(xù)性表達(dá)可能參與了癲癇自發(fā)性發(fā)作過程［23］。我們推測癲癇發(fā)作后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，引起神經(jīng)退行性變，血腦屏障破壞甚至導(dǎo)致腦水腫，這些病理改變同時維持了炎性因子信號表達(dá)，使得癲癇腦內(nèi)持續(xù)性炎癥刺激，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、興奮性增高以及血腦屏障破壞，最終導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作。有研究證實星形膠質(zhì)細(xì)胞對整個癲癇形成過程中維持炎性活化狀態(tài)有重要作用。

綜上所述，可能是在癲癇發(fā)作早期，炎性因子大量表達(dá)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上AQP4 表達(dá)增加，致使星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫性損傷激活NF-κB 等信號分子促進(jìn)炎性因子的分泌，使癲癇狀態(tài)下慢性炎癥持續(xù)存在。然而本實驗沒有抑制炎性因子表達(dá)來研究炎性因子表達(dá)對AQP4 的調(diào)控作用。因此，需進(jìn)一步研究AQP4 與炎癥因子在癲癇反復(fù)發(fā)作過程中的關(guān)系，為控制癲癇發(fā)作和預(yù)防復(fù)發(fā)提供新的思路。

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