篩選調(diào)控黃芪次生代謝產(chǎn)物黃酮含量誘導(dǎo)子的研究

孫麗英，郭春樂，閆嵩，任偉超，劉振鵬，張開雪，馬偉，劉秀波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007)

誘導(dǎo)子能引起植物抗病生理過程，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素并引起植物過敏反應(yīng)的因子，能夠開啟代謝過程中酶的活性，因而能夠增加次生代謝物的含量，有時甚至可以誘導(dǎo)出新的化合物［1-2］。從目前的研究來看，誘導(dǎo)子對次生代謝途徑的調(diào)控具有專一性，和對同一代謝途徑調(diào)控的誘導(dǎo)子多樣性。如真菌誘導(dǎo)子可快速激活百脈根的毛狀根中的苯丙氨酸氨基裂解酶，合成異黃酮化合物，而對其它無直接關(guān)系的酶沒有明顯的作用;也有研究者發(fā)現(xiàn)用12種不同真菌菌絲體勻漿對長春花細胞懸浮培養(yǎng)，其吲哚生物堿含量和對照組比較均明顯提高［3-4］。無土栽培在過去幾十年的全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中因其具有無公害生產(chǎn)的環(huán)境優(yōu)勢越來越受到歡迎，因而也成為誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化最佳載體。

1 材料方法

1.1 試驗材料

本試驗所用膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)種子，由黑龍江中醫(yī)藥大學提供。在黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園日光溫室內(nèi)無土栽培培養(yǎng)，營養(yǎng)液采用Hoagland＆Aunon全營養(yǎng)液，光照強度2000～2500Lux，日溫25～28℃，夜溫17～20℃，相對濕度60%～80%。黃芪苗期無土栽培裝置已申請實用新型專利，專利號:ZL201220490816.3。用于試驗的黃芪苗齡35天，苗高15cm，七片真葉。處理采樣后，105℃烘干0.5h殺青，80℃烘至恒重，利用球磨機1600轉(zhuǎn)20min粉碎，用于待測成分的提取。黃芪黃酮的含量測定采用722型數(shù)顯可見分光光度計。

1.2 試驗方法

本試驗采用L24(6×4×23)不等水平正交追加試驗設(shè)計，利用SPASS軟件進行正交試驗設(shè)計，因素水平見表1。

表1 試驗因素水平表

處理后對各次試驗的黃芪植株根、莖、葉的黃酮含量進行測量計算，具體方法如下。

1.2.1 黃酮含量測定［5-6］

對照品溶液的制備:精密稱取對照品蘆丁0.998mg，置10mL容量瓶中，加30%乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻制成標準溶液。

標準曲線的制備:用移液器精密量取對照品溶液0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分別置1.5mL離心管，分別加入5%亞硝酸鈉0.03mL，混勻放置6min，加入10%硝酸鋁溶液0.03mL，混勻放置6min，加入氫氧化鈉溶液0.4mL，分別用30%的乙醇定容至1ml，混勻放置15min，在510nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線，Y=1.222X+0.0075，R2=0.9999。

黃酮提取方法:5g實驗樣品，20倍體積的70%乙醇室溫浸提10h，融化后離心20min，取兩份適量上清液揮干，用30%乙醇定容，充分溶解離心5min，取上清液做為待測樣品。

樣品黃酮含量的測定:用移液器精密量取兩份待測樣品0.54mL，分別置于1.5ml離心管中，其中一管按標準曲線的制備，依次加入顯色劑，另一管則加入和顯色劑等體積的水做空白對照，顯色后12000rpm離心5min，上機比色測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品黃酮含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS軟件及Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮含量方差分析結(jié)果

將經(jīng)各個處理組合處理完畢后測得的黃芪植株根、莖、葉的黃酮含量數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表2。

從各因素對黃芪黃酮含量影響的方差分析表2可以看出，誘導(dǎo)因子種類處理因素對黃芪根、莖的黃芪黃酮含量影響有極顯著差異，對黃芪葉黃酮含量影響有顯著差異;誘導(dǎo)子處理時間因素對黃芪根、莖、葉黃酮含影響存在極顯著差異;誘導(dǎo)子處理部位因素對黃芪根黃酮含量的影響未達到顯著水平，對黃芪黃酮苷含量的影響達到了顯著水平，對黃芪葉黃酮含量的影響達到了顯著水平，也就是誘導(dǎo)子進行地下部位處理的黃芪根黃酮含量和誘導(dǎo)子進行地上部位處理的黃芪根黃酮含量之間差異不顯著，誘導(dǎo)子進行地下部位處理的黃芪莖黃酮含量顯著高于誘導(dǎo)子進行地上部位處理的黃芪莖黃酮含量，誘導(dǎo)子進行地下部位處理的黃芪葉黃酮含量極顯著高于誘導(dǎo)子進行地上部位處理的黃芪葉黃酮含量。

表2 黃芪黃酮含量方差分析

2.2 黃酮含量多重比較結(jié)果分析

2.2.1 誘導(dǎo)因子的多重比較

將各誘導(dǎo)子處理種類因素對黃芪黃酮含量影響的數(shù)據(jù)結(jié)果做進一步的單因素多重比較，對葉的黃酮含量影響的多重比較結(jié)果如表3，對莖黃酮含量影響的多重比較結(jié)果見表4，對根黃酮含量影響的多重比較結(jié)果見表5。

表3 葉中A因素各水平多重比較

從表3中可以看出，誘導(dǎo)子因素中的硝酸銀、水溶液處理水平的黃芪葉黃酮含量顯著高于吐溫、內(nèi)生菌發(fā)酵液處理水平的黃芪葉黃酮的含量;硝酸銀、水、茉莉酸甲酯、土豆培養(yǎng)基、水楊酸溶液處理水平之間的黃芪葉黃酮含量無明顯差異;茉莉酸甲酯、土豆培養(yǎng)基、水楊酸、吐溫、內(nèi)生菌發(fā)酵液處理水平之間的黃芪葉黃酮含無顯著差異。

表4 莖中A因素各水平多重比較

從表4中可以看出，誘導(dǎo)子處理種類因素中硝酸銀溶液處理水平的黃芪莖黃酮含量顯著高于土豆培養(yǎng)基、茉莉酸甲酯、水、吐溫、內(nèi)生菌發(fā)酵液、水楊酸溶液處理水平的黃芪莖黃酮的含量;土豆培養(yǎng)基、茉莉酸甲酯溶液處理水平的黃芪莖黃酮的含量顯著高于內(nèi)生菌發(fā)酵液、水楊酸溶液處理水平的黃芪莖黃酮含量，土豆培養(yǎng)基、茉莉酸甲酯、水、吐溫溶液處理水平之間的黃芪莖黃酮含無顯著差異;水、吐溫溶液處理水平的黃芪莖黃酮含量顯著高于水楊酸溶液處理水平黃芪莖黃酮的含量，水、吐溫、內(nèi)生菌發(fā)酵液處理水平之間的黃芪莖黃酮含無顯著差異;內(nèi)生菌發(fā)酵液和水楊酸溶液處理水平之間的黃芪莖黃酮含量無顯著差異。

表5 根中A因素各水平多重比較

從表5中可以看出，誘導(dǎo)子處理種類因素中硝酸銀溶液處理水平的黃芪根黃酮含量顯著高于吐溫、土豆培養(yǎng)基、水楊酸、茉莉酸甲酯、內(nèi)生菌發(fā)酵液、水溶液處理水平黃芪根黃酮的含量;吐溫、土豆培養(yǎng)基、水楊酸、茉莉酸甲酯溶液處理水平的黃芪根黃酮含量顯著高于水溶液處理水平的黃芪根黃酮的含量，吐溫、土豆培養(yǎng)基、水楊酸、茉莉酸甲酯、內(nèi)生菌發(fā)酵液處理水平之間的黃芪根黃酮含無顯著差異;內(nèi)生菌發(fā)酵液和水溶液處理水平之間的黃芪根黃酮含量無顯著差異。

綜上，從誘導(dǎo)子處理種類因素對黃芪黃酮含量影響的多重比較結(jié)果來看，對黃芪根、莖、葉黃酮影響的最佳處理水平是均是硝酸銀溶液。

2.2.2 時間因素的多重比較

將各誘導(dǎo)子處理時間因素對黃芪黃酮含量影響的數(shù)據(jù)結(jié)果做進一步的單因素多重比較，對葉的黃酮含量影響的多重比較結(jié)果如表6，對莖黃酮含量影響的多重比較結(jié)果見表7，對根黃酮含量影響的多重比較結(jié)果見表8。

表6 葉中B因素各水平多重比較

從表6中可以看出，誘導(dǎo)子處理時間因素中12天、0天處理水平的黃芪葉黃酮含量顯著高于3天、9天、6天處理水平黃芪葉黃酮的含量，12天、0天、3天處理水平之間的黃芪葉黃酮含量無顯著差異;3天處理水平的黃芪葉黃酮含量顯著高于6天處理水平的黃芪葉黃酮的含量，3天、9天處理水平之間的黃芪葉黃酮含無顯著差異;6天和9天處理水平之間的黃芪葉黃酮含量無顯著差異。

表7 莖中B因素各水平多重比較

從表7中可以看出，誘導(dǎo)子處理時間因素的12天處理水平的黃芪莖黃酮含量顯著高于6天、9天、3天、0天處理水平黃芪莖黃酮的含量;6d處理水平的黃芪莖黃酮含量顯著高于3天、0天天處理水平的黃芪莖黃酮的含量，6天、9天處理水平之間的黃芪莖黃酮含量無顯著差異;9天、3天處理水平的黃芪莖黃酮含量顯著高于0天處理水平的黃芪莖黃酮的含量，9天、3天處理水平之間的黃芪莖黃酮含無顯著差異。

表8 根中B因素各水平多重比較

從表8中可以看出，誘導(dǎo)子處理時間因素的9天處理水平的黃芪根黃酮含量顯著高于3天、6天、12天、0天處理水平的黃芪根黃酮的含量;3天、6天處理水平的黃芪根黃酮含量顯著高于12天、0天處理水平的黃芪根黃酮含量，3天、6天處理水平之間的黃芪根黃酮含量無顯著差異;12天處理水平的黃芪根黃酮含量顯著高于0天處理水平的黃芪根黃酮的含量。

綜上，從誘導(dǎo)子處理時間因素對黃芪黃酮含量影響的多重比較結(jié)果來看，對黃芪根黃酮含量影響最佳處理水平是9天;對黃芪莖黃酮含量影響的最佳處理水平是12天;對黃芪葉黃酮含量影響的最佳處理水平是12天。

3 結(jié)論

從正交試驗進行方差分析和多重比較分析結(jié)果來看，影響黃芪葉和莖黃酮含量的最佳處理組合是A4B5C2，也就是硝酸銀溶液進行地下部位處理12天的處理組合;影響黃芪根黃酮含量的最佳處理組合是A4B4C2，也就是硝酸銀溶液進行地下部位處理9天的處理組合。

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