茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

宋 瀟，謝昭明，黃 丹，劉塔斯，鄧富民，舒志芬，劉金香，冉玲菊，李如意（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)/湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長(zhǎng)沙 40208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，長(zhǎng)沙 4003）

茯苓皮為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf干燥菌核的黑色外皮，性平，味甘、淡[1]。其具有利水消腫的作用，主要用于治療小便不利、水腫[2]。茯苓野生資源很少、不易發(fā)現(xiàn)和采挖，全國雖有近20個(gè)省栽培茯苓，但茯苓主要產(chǎn)于安徽、湖北、湖南、云南、貴州等地[3]。隨著《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（試行）》（GAP）的實(shí)施和推廣，茯苓皮藥材質(zhì)量與產(chǎn)地相關(guān)性的研究意義逐漸突出。中藥指紋圖譜為新興的中藥質(zhì)量研究可行性手段之一[4]。本文對(duì)全國茯苓栽培產(chǎn)地的18批茯苓皮藥材進(jìn)行了高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜方法學(xué)研究，以期通過建立茯苓皮藥材HPLC指紋圖譜的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為茯苓皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和GAP種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1260型HPLC儀，包括二極管陣列（DAD）檢測(cè)器、在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱（美國Agilent公司）；色譜數(shù)據(jù)的采集與處理由Agilent化學(xué)工作站完成；KQ2200B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

茯苓酸A對(duì)照品（成都克洛瑪有限公司，批號(hào)：140213）；甲醇、磷酸、乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

本試驗(yàn)所用茯苓皮藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf干燥菌核的黑色外皮，共18批。18批茯苓皮藥材來源見表1。

表1 18批茯苓皮樣品來源Tab 1 Origins of 18 batches of Cortex Poriae samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～25 min，40%～48%A；25～40 min，48%A；40～50 min，48%～75%A；50～76 min，75%～90%A；76～80 min，90%～100%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；記錄時(shí)間：85 min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取茯苓酸A對(duì)照品6.7 mg，置于50 mg量瓶中，加流動(dòng)相[乙腈-0.1%磷酸水（70∶30，V/V）]溶解并稀釋至刻度。

2.3 供試品溶液的制備

取茯苓皮藥材粉末（過80目篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理20 min，冷卻，補(bǔ)足損失的甲醇量，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茯苓皮藥材粉末（過80目篩）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.5 茯苓皮HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 根據(jù)18個(gè)產(chǎn)地茯苓皮藥材供試品溶液HPLC圖提供的相關(guān)參數(shù)，建立茯苓皮藥材三萜類成分的HPLC指紋圖譜（圖1）。比較18批茯苓皮樣品的色譜圖，確定了16個(gè)共有峰。其中7號(hào)峰峰面積較大，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)歸屬為茯苓酸A，且在不同批次樣品中均穩(wěn)定存在，故選其為參照峰，其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均通過7號(hào)峰比對(duì)獲得。結(jié)果顯示，各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜3.0%，但各個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD有很大差異，以峰1、5、8、15、16所代表成分最為明顯，說明這5個(gè)色譜峰所代表的成分在各藥材樣品中的量存在很大差異（圖2）。

圖1 18批茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 18 batches of Cortex Poriae

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 首先對(duì)18批茯苓皮樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間均聯(lián)法（Between group linkage），以夾角余弦（Consine）作為樣品的分類依據(jù)。18批樣品可分為兩類，樣品3、6、9、14批為一類；樣品1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、15、16、17、18批為另一類，聚類分析結(jié)果見圖3。

圖2 18批茯苓皮藥材共有峰的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of 18 batches of Cortex Poriae common peak

圖3 18批茯苓皮藥材的聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis of 18 batches of Cortex Poria

采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004版）對(duì)所得的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過多點(diǎn)校正的方法對(duì)色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配生成樣品的色譜指紋圖譜共有模式，以第7批藥材圖譜作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表2。結(jié)果，3、6、9、14批樣品相似度小于0.95，其余樣品相似度均在0.95以上。此結(jié)果與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致，2種方法得到了相互驗(yàn)證，因此可以認(rèn)為相似度在0.95以上的為推薦品，0.95以下的為非推薦品。

表2 18批茯苓藥材的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Results of similarity evaluation of 18 batches of Cortex Poriae

3 討論

3.1 提取溶劑和方法的考察

對(duì)提取溶劑甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯進(jìn)行考察，以甲醇提取的樣品色譜峰個(gè)數(shù)較多、峰面積較大，故提取溶劑選擇甲醇。筆者對(duì)超聲提取法和加熱回流提取法進(jìn)行比較，2種提取方法提取效率相當(dāng)，考慮到超聲提取法操作較簡(jiǎn)便，故提取方法選擇超聲提取法；同時(shí)又對(duì)不同的提取時(shí)間（10、20、30、40 min）進(jìn)行考察，20 min及以后的提取效率基本一致，故選擇超聲時(shí)間為20 min。故確定提取方法為甲醇超聲20 min。

3.2 色譜條件的考察

筆者分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸4個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-水-磷酸流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析，因此確定乙腈-水-磷酸作為本研究的流動(dòng)相[5]。隨后又分別考察了25、30、35 ℃3個(gè)檢測(cè)柱溫，結(jié)果表明色譜柱檢測(cè)溫度在35 ℃時(shí)，分離度最好、峰形較好。故選擇柱溫為35 ℃條件下進(jìn)行茯苓皮藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用DAD檢測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)全波長(zhǎng)掃描，在210 nm波長(zhǎng)下，色譜圖基線噪音較低，特征峰響應(yīng)較高，色譜峰信息較完全。綜合比較后，選擇210 nm作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了茯苓皮藥材的HPLC指紋圖譜，并采用不同分析方式將18批茯苓皮藥材分為兩大類[6]。雖然上述兩大類茯苓皮HPLC指紋圖譜十分相似，但3、6、9、14批茯苓皮樣品的各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于其他批號(hào)茯苓皮樣品，表明3、6、9、14批茯苓皮樣品質(zhì)量次于其他批號(hào)的茯苓皮樣品。由此提示茯苓皮藥材的質(zhì)量與土壤類型、蓋土厚度、海拔、緯度、氣候條件、菌種、種植方法等密切相關(guān)，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：224.

[2]張怡莎，陳華國，周欣，等.不同產(chǎn)地茯苓及茯苓皮中多糖成分的研究[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，28（3）：101.

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[5]曾超，陸東，段偉昌，等.肉桂配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2014，25（7）：635.

[6]陳蓉，沈蓓，吳啟南.基于主成分分析和聚類判別模式對(duì)不同產(chǎn)地芡實(shí)HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2012，34（5）：781.