耐受自身代謝產(chǎn)物及耐二甲基亞砜紅霉素高產(chǎn)菌株的選育

沈小靜，張萍，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

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耐受自身代謝產(chǎn)物及耐二甲基亞砜紅霉素高產(chǎn)菌株的選育

沈小靜，張萍*，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

為提高紅霉素發(fā)酵單位，考察了二甲基亞砜(DMSO)添加時間和體積分數(shù)對紅霉素合成的影響，采用篩選自身代謝產(chǎn)物突變株的方法，將突變株進行常壓室溫等離子體(ARTP)誘變和耐受高濃度DMSO處理。結(jié)果顯示，在36 h向發(fā)酵瓶中添加30000 μg/mL紅霉素，篩選得到化學(xué)效價比對照提高22.4%的菌株。DMSO最適添加時間為發(fā)酵48 h，最適添加劑量為0.2%，其可提高發(fā)酵單位10.1%。

紅霉素；耐受自身代謝產(chǎn)物；二甲基亞砜；遺傳穩(wěn)定性；常壓室溫等離子體

紅霉素(Erythromycin，Er)是一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，包括紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素C(ErC)、紅霉素D(ErD)、紅霉素E(ErE)和紅霉素F(ErF)。在臨床上廣泛應(yīng)用的是紅霉素A。紅霉素A的生物合成途徑中紅霉素D是一個很關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。紅霉素D沿兩條分支途徑轉(zhuǎn)化為紅霉素A，途徑I：紅霉素D在羥基化酶EryK的作用下羥基化，生成紅霉素C，然后在甲基化酶EryG的作用下甲基化，生成紅霉素A；其中途徑Ⅱ：紅霉素D在甲基化酶EryG的作用下甲基化，生成紅霉素B，然后在羥基化酶EryK的作用下羥基化，生成紅霉素A。據(jù)文獻報道[1-3]，途徑I為紅霉素主要代謝途徑，即由紅霉素B 轉(zhuǎn)化成紅霉素A 的通量小，紅霉素B 容易積累，而由紅霉素C 轉(zhuǎn)化成紅霉素A 的通量大，強化甲基化，紅霉素C 不易積累，能得到高百分含量的紅霉素A，可使發(fā)酵液的化學(xué)效價顯著提高[4]。

據(jù)報道[5]，對于羥基化反應(yīng)，小分子有機溶劑如二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、丙酮等可使細胞色素P450單加氧酶mRNA量增加，最終使細胞色素P450單加氧酶(EryK)表達量增加。丁盼盼等研究了搖瓶和發(fā)酵罐中DMSO對紅霉素合成的影響，確定合適的添加時間及劑量，使紅霉素效價比對照提高11.6%[6]。據(jù)此推測在發(fā)酵過程中向培養(yǎng)基中添加DMSO，可能會增加EryK的表達量從而促進紅霉素效價的提高。本文考察了DMSO添加時間和體積分數(shù)對紅霉素合成的影響。影響抗生素產(chǎn)生菌生物合成能力的因素有很多，獲得對自身代謝產(chǎn)物耐受能力高的突變株，是菌種選育的有效手段和方法。這個方法對某個菌株選育的初期或者是對高產(chǎn)菌株進行純化時，尤為有效[7]。據(jù)此，為了提高紅霉素的發(fā)酵單位，借鑒前人的經(jīng)驗，在紅霉素選育過程中首先采用了篩選自身代謝產(chǎn)物突變株的方法，然后將突變株進行ARTP誘變處理，再結(jié)合高濃度DMSO耐受性實驗，最終使菌種具有耐自身代謝產(chǎn)物及耐受高濃度DMSO的特性，并將獲得的突變菌株進行分離純化和穩(wěn)定性實驗，使得紅霉素產(chǎn)量大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)，CGMCC，經(jīng)本公司分離純化得到生產(chǎn)能力穩(wěn)定的菌株：EM13-165，用沙土管保藏。

1.1.2 主要設(shè)備 旋轉(zhuǎn)搖瓶機，XDW25/96型，四川長征制藥機械廠；紫外可見分光光度計，

UV-1800，日本島津；恒溫、凈化工作系統(tǒng)；ARTP 生物育種機，ARTP—Ⅱ型，清華大學(xué)與北京思清源生物科技有限公司聯(lián)合開發(fā)；高效液相色譜儀，1100 /1200 Series ，美國Agilent。

1.1.3 試劑及原料 黃豆餅粉、玉米淀粉、糊精、碳酸鈣均購自本地；玉米漿購自華北制藥康欣股份有限公司； 硫酸銨、氯化鈉、葡萄糖、正丙醇、磷酸氫二鉀均為分析純，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙腈為色譜純；水為重蒸水；紅霉素對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0031208，紅霉素A組分91.3 %)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 參照文獻[8]培養(yǎng)制備培養(yǎng)基。

1.2.2 耐受自身代謝產(chǎn)物突變株篩選 將32 ℃培養(yǎng)成熟的斜面，用挖塊法挖取約2 cm2接種到種瓶培養(yǎng)基(300 mL三角瓶，裝量30 mL)中按上述方法進行培養(yǎng)。于發(fā)酵0、12、24、36 h，按搖瓶體積分別加入不同劑量(10000、20000、30000、40000、50000 μg/mL)的紅霉素無菌粉(用Co60滅菌)，在搖瓶培養(yǎng)到96、120、144、168 h時，開始以玻璃棒沾取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)物涂斜面。斜面在32 ℃培養(yǎng)9 d，再進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并使用紫外分光光度法(UV)檢測化學(xué)效價。

1.2.3 耐DMSO突變株篩選 首先分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h時向搖瓶中添加0.2%(體積分數(shù)，下同)DMSO，測定其化學(xué)效價，考察其對紅霉素效價的影響以確定最適添加時間。以篩選得到的自身代謝產(chǎn)物突變株S-17做為ARTP誘變處理出發(fā)菌株，篩選耐DMSO突變株。以99.99%氦氣作為工作氣體，氦氣流量10 SLM；處理功率120 W；樣品與等離子體發(fā)生器出口距離2 mm；處理樣品為20 μL孢子懸液；為了尋找最佳的誘變處理時間，分別考察了照射時間為20、40、60、80、100、120 s時的誘變致死率。選擇較適的等離子誘變劑量進行菌種誘變，將誘變孢子懸液適當稀釋后涂布在含DMSO(體積分數(shù)分別為0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%)不同濃度平板上，32 ℃培養(yǎng)觀察孢子萌發(fā)和菌絲生長情況。隨機挑取單菌落，接種斜面培養(yǎng)。待孢子成熟，按1.2.1項方法進行培養(yǎng)，并分別在發(fā)酵48 h添加與篩選平板相同劑量的DMSO進行初篩，使用紫外分光光度法(UV)測定其化學(xué)效價。對于初篩效價相對較高的菌株按同樣的方法進行復(fù)篩，使用紫外分光光度法(UV)測定其化學(xué)效價，對復(fù)篩效價較高的菌株使用高效液相色譜法(HPLC)測定紅霉素A的含量。

1.2.4 紫外分光光度法(UV)檢測方法 參照文獻[9]，本法是硫酸水解法，即紅霉素經(jīng)硫酸水解后呈黃色，于483 nm 處有吸收峰，使用紫外可見分光光度計可以定量測定。發(fā)酵液經(jīng)離心后，根據(jù)確定好的倍數(shù)吸取一定量的濾液，用0.35% 碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁酯20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁酯液中加入無水硫酸鈉1 g 左右(可酌量多加使丁酯液澄清) ，振蕩至透明。準確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸(0.1 mol/L ) 10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL 放入另一試管中，加入硫酸(8 mol/L ) 5 mL，搖勻，放入50 ℃水浴中，保溫30 min取出冷卻。在483 nm處測定吸光度值，同時以蒸餾水為空白，用所得的吸光度值查標準曲線。效價= 查出數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 UV標準曲線制備方法 參考文獻[10]，精密稱量紅霉素對照品0.0502 g 置100 mL 容量瓶中，加乙醇20 mL溶解，用水稀釋至刻度。準確量取該標準品溶液分別置于量瓶中，用純化水稀釋使其最終濃度相當于含紅霉素0、1、5、10、20、30、40、50 mg/ L。分別加入硫酸溶液(5 mol/L)12 mL，在80 ℃水浴7 min，取出立即水浴冷卻至室溫，用硫酸溶液稀釋至刻度，在483 nm處測定吸光度，以效價為縱坐標，吸光度為橫坐標做回歸方程(r≥0.999)，列表備用。

1.2.6 高效液相色譜法(HPLC)檢測方法 參考文獻報道[11]，色譜柱為反相C18柱RP-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：V(0.025mol/L的K2HPO4溶液)∶V(乙睛) = 60∶40；流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫50 ℃；進樣量100μL。

1.2.7HPLC標準曲線制備方法 取含紅霉素0、1、5、10、20、30、40、50mg/L的標準品溶液分別進樣，以標準品濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y=0.0899X+0.0587(r=0.9999)。紅霉素A在0.375～7.690mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅霉素標準曲線 標準曲線如圖1所示。

圖1 紅霉素標準曲線圖

2.2 出發(fā)菌株耐受紅霉素劑量的初步選擇 以紅霉素發(fā)酵24 h加入時間的菌絲生長狀況為參考確定耐受劑量，結(jié)果如表1所示。

表1 耐受劑量選擇實驗結(jié)果表

由表1可知，隨著紅霉素濃度的增加，菌絲長勢加快，外觀顏色隨耐受劑量增加逐漸加深；當耐受劑量達30000 μg/mL以后，隨耐受劑量的增加，菌絲生長減緩，外觀顏色隨耐受劑量的增加而變淺。根據(jù)以上實驗，選擇30000 μg/mL耐受劑量做進一步考察。

2.3 耐受劑量 劑量在30000 μg/mL情況下，向搖瓶加紅霉素的時間、從發(fā)酵搖瓶傳斜面的時間與發(fā)酵單位的關(guān)系結(jié)果如表2所示。

表2 紅霉素不同加入時間、涂斜面時間和發(fā)酵單位的關(guān)系

從表2可以看出，搖瓶添加紅霉素時間36 h，發(fā)酵單位較高；斜面涂抹時間120 h，發(fā)酵單位最高。通過在36 h添加紅霉素并在發(fā)酵120 h涂斜面，最終篩選出一株S-17耐受菌株，其生產(chǎn)能力比對照菌株提高22.4%，部分菌株效價提高幅度結(jié)果如圖2所示。

圖2 耐受自身代謝產(chǎn)物突變株效價提高幅度

2.4 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響 分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h時添加0.2%DMSO，考察其對紅霉素效價的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響

由圖3可以看出，在發(fā)酵0、48、72 h時添加0.2%的DMSO均可提高紅霉素效價，其中在發(fā)酵48 h添加DMSO時，紅霉素效價達到最大。因此，確定DMSO最適添加時間為48 h。

2.5 等離子體誘變劑量的確定 從表3可以看出，在ARTP照射時間為80 s時，致死率達到98.9%，當照射時間為20 s和60 s時，致死率分別為38.8%和90.4%。對于不同的菌株，在不同的致死率下，其正突變的概率是不容易確定的，所以為了增加誘變篩選的幾率，將ARTP誘變劑量為20、60、80 s三個不同致死率下的孢子懸液進行混合后涂布平板用于篩選。

表3 等離子體誘變死亡率

2.6 等離子體誘變結(jié)合耐DMSO突變株篩選 將菌株s-17經(jīng)ARTP誘變后，在不同DMSO濃度的固體平板上的孢子萌發(fā)實驗表明：ARTP誘變提高了部分突變株的DMSO耐受能力。從表4可以看出在培養(yǎng)5 d后，突變株sq-124、sq-205在DMSO達0.2%時仍可正常萌發(fā)，突變株sq-181、sq-210、sq-229孢子在DMSO高達0.25%時仍可正常萌發(fā)，而出發(fā)菌株在大于0.15%即不能萌發(fā)。

表4 菌株在不同濃度DMSO固體平板上的生長情況

對DMSO(體積分數(shù)分別為0.1%，0.15%，0.2%，0.25%)不同濃度平板上隨機挑選得到的320個菌落進行發(fā)酵能力考察，統(tǒng)計菌群分布情況見圖4。UV檢測結(jié)果顯示以DMSO體積分數(shù)0.2%進行篩選，高效價菌株群比例占優(yōu)勢。最終篩選出5株高產(chǎn)菌株，其中一株菌株sq-181比出發(fā)菌株s-17的效價提高10.1%(圖5)。高產(chǎn)菌株與對照菌株的HPLC檢測結(jié)果見表5。

圖4 DMSO不同濃度篩選菌株搖效瓶價分布圖

圖5 耐DMSO突變株效價提高幅度

表5 高產(chǎn)菌株的紅霉素A與其他相關(guān)物質(zhì)的HPLC檢測結(jié)果

2.7 高產(chǎn)突變株傳代穩(wěn)定性考察 將突變株sq-181、對照株EM13-165分別連續(xù)傳4代，同批搖瓶驗證，結(jié)果如表6。sq-181的F1～F3代發(fā)酵水平保持一致，未退化，與對照菌株相比傳代穩(wěn)定性有明顯優(yōu)勢。

表6 新菌株傳代穩(wěn)定性考察

注：發(fā)酵水平相對對照菌株為100計算

3 討論與小結(jié)

通過在紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)36 h時添加30000 μg/mL紅霉素，篩選得到一株菌株s-17，其化學(xué)效價比對照提高22.4%。說明紅色糖多孢菌對自身次生代謝產(chǎn)物的耐受程度與其產(chǎn)生抗生素水平有一定的內(nèi)在聯(lián)系。杜潤泮等[12]對三株卡那霉素鏈霉菌進行直接篩選耐高濃度自身代謝產(chǎn)物的抗反饋和抗阻遏突變型，最終篩選出兩株菌耐受卡那霉素水平提高近100倍，發(fā)酵單位比原始菌株分別提高33.3%和28.3%。于秀蓮等[9]對一株降紅小單孢菌進行搖瓶耐受自身代謝產(chǎn)物實驗，得到一株新菌株，耐受慶大霉素的濃度大幅提高，生產(chǎn)能力提高22.8%。借鑒前人的經(jīng)驗，本文采用耐受高劑量紅霉素的方法，直接淘汰低產(chǎn)菌株，取得了較好的效果。而本實驗又將其與其他育種方法相結(jié)合，以s-17菌株為出發(fā)菌株進行耐受高濃度DMSO實驗，同時使用ARTP作為新型的誘變手段，大大提高正變頻率，篩選出一株菌株sq-181比出發(fā)菌株的效價提高10.1%。

DMSO是具有一定毒性的物質(zhì)，添加量過多會導(dǎo)致紅霉素效價顯著下降，因此適時適量地添加DMSO才會在基本不影響菌體正常代謝的前提下提高紅霉素效價。本實驗未深入研究DMSO對菌體的負面影響，但因其毒性和化學(xué)性質(zhì)，不可忽略可能帶來的潛在不良后果。本文并未使用篩選得到的高產(chǎn)突變株進行發(fā)酵罐上罐驗證，考察其增產(chǎn)效果，所以還有待今后更多的上罐發(fā)酵試驗。但更重要的是摸索和改革發(fā)酵工藝，研究突變菌株的最適發(fā)酵條件，使得耐受高濃度自身代謝產(chǎn)物以及高濃度DMSO突變菌株的高產(chǎn)特性獲得充分應(yīng)用，為提高紅霉素的發(fā)酵產(chǎn)量開辟一個新途徑。

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(編輯：侯向輝)

Screening of High Yield Erythromycin Producing Strain by Combined Drug Resistant Mutation

SHEN Xiao-jing, ZHANG Ping*, SHI Yan-peng

(NingxiaTairuiPharmaceuticalCo.,Ltd，StrainsInstitute,Yinchuan750101,China)

To improve the production of erythromycin,the mutated strains were selected by use of self-secondary metabolites.The mutant was further treated by ARTP and DMSO.The results showed that the chemical titre of erythromycin was increased by 22.4%of the control when 30000 μg/mL erythromycin was added into the medium at 36 h of fermentation ofSaccharopolysporaerythraea.The most suitable adding time of DMSO was at 48 h of fermentation and the most suitable volume fraction was 0.2%.Adding DMSO could increase the yield of erythromycin by 10.1%.

erythromycin;self-secondary metabolites resistant;dimethyl sulfoxide(DMSO); hereditary stability; atmospheric and room temperature plasma

沈小靜，碩士，從事抗生素發(fā)酵菌種培養(yǎng)、選育研究。

張萍。E-mail: shiyanpeng@tairuiworld.com

2015-07-07

A

1002-1280 (2015) 09-0019-06

S859.796