氟苯尼考注射液中非法添加多西環素檢查方法的建立

楊修鎮，李贊陽，徐恩民，李淑花，王燕，張傳法

(1.山東省獸藥質量檢驗所；山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南 250022；2.青島康地恩動物藥業有限公司，山東青島 266111)

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氟苯尼考注射液中非法添加多西環素檢查方法的建立

楊修鎮1，李贊陽2，徐恩民1，李淑花1，王燕1，張傳法1

(1.山東省獸藥質量檢驗所；山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南 250022；2.青島康地恩動物藥業有限公司，山東青島 266111)

為建立氟苯尼考注射液中非法添加多西環素高效液相檢查方法，研究使用C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，以醋酸鹽緩沖液[0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸二鈉-三乙胺(100∶10∶1)，調節pH值至8.8]-乙腈(85∶15)為流動相，采用二極管陣列檢測器，波長采集范圍為200～400 nm，記錄色譜圖波長為269 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。結果表明，多西環素進樣濃度在0.015～0.96 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=1.0000)；平均回收率為99.4%(n=9)，RSD為0.3%。本方法簡便、準確、可行，適用于氟苯尼考注射液中非法添加多西環素的檢測。

高效液相色譜法；氟苯尼考注射液；多西環素

氟苯尼考收載于《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版一部，是動物專用的氯霉素類新型廣譜抗生素。該藥以甲砜基取代氯霉素分子結構中的硝基，消除了不可逆性致再生障礙性貧血的毒副作用；以氟基取代甲砜霉素分子結構中α-甲基位上的羥基，不僅抗菌活性增強，而且對大部分耐氯霉素和甲砜霉素的菌株仍有活性[1-2]。有研究表明氟苯尼考與多西環素聯合在體外對雞大腸桿菌雖呈無相關作用，但當兩藥聯合治療由該菌引起的疾病時可適當減小氟苯尼考的用量[3]。目前僅有飼料中非法添加多西環素的檢測方法[4]，但是飼料與獸藥的基質是完全不同的，因此，本研究對氟苯尼考注射液中非法添加多西環素的檢查方法進行了研究。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)。多西環素對照品，批號130485-201202，中國食品藥品檢定研究院。氟苯尼考注射液(批號150201，山東魯港福友藥業有限公司提供；批號20150101，標識生產單位為江西某生物科技有限公司)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜條件 根據參考文獻[5]方法，色譜柱為C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為醋酸鹽緩沖液[0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸二鈉-三乙胺(100：10：1)，調節pH值至8.8]-乙腈(85：15)，二極管陣列檢測器，波長采集范圍為200 ～400 nm，記錄269 nm波長處的色譜圖，流速1 mL/min，進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取多西環素對照品56 mg(含量85.7%)置50 mL量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.96 mg/mL的多西環素對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋成0.12 mg/mL的多西環素對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取氟苯尼考注射液適量，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL約含氟苯尼考0.6 mg的溶液(另取本品，同時測定其相對密度，將稱樣量換算成毫升數，計算)，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 取不含多西環素的氟苯尼考注射液(批號150201，山東魯港福友藥業有限公司提供)按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 陽性樣品溶液制備 取不含多西環素的氟苯尼考注射液(批號150201，山東魯港福友藥業有限公司提供)，每1 mL添加多西環素30 mg后按供試品溶液制備方法制備陽性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、陽性樣品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，陽性樣品溶液色譜中在與對照品色譜相應的位置出相同的峰，陰性樣品無干擾，結果見圖1-圖3，多西環素對照品PDA光譜圖見圖4。

圖1 多西環素對照品溶液HPLC色譜圖

圖2 陽性樣品溶液HPLC色譜圖

圖3 陰性樣品溶液HPLC色譜圖

圖4 多西環素對照品PDA光譜圖

2.4 檢出限 按上述色譜條件，將對照品溶液進一步稀釋，同時記錄色譜圖及光譜圖，報告溶液光譜圖失真的最大濃度為檢出限，多西環素光譜失真的最大進樣濃度為6 μg/mL。檢出限根據氟苯尼考注射液規格不同分別為3.0 mg/mL(規格2 mL∶1.5 g、100 mL∶3 g)、2.0 mg/mL(規格5 mL∶1 g、10 mL∶2 g)、1.5 mg/mL(規格5 mL∶0.75 g、10 mL∶1.5 g)、1.0 mg/mL(規格5 mL∶0.5 g、100 mL∶10 g)、0.5 mg/mL(規格5 mL∶0.25 g、10 mL∶0.5 g、50 mL∶2.5 g、100 mL∶5 g)。

2.5 線性關系考察 精密量取多西環素對照品貯備液，用0.01 mol/L鹽酸溶液逐級稀釋成0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96 mg/mL的系列溶液，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，以峰面積(y)為縱坐標，濃度為橫坐標(x，mg/mL)，進行線性回歸分析。回歸方程為：y=2.1877×107x-64426(r=1.0000)，結果表明多西環素進樣濃度在0.015～0.96 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

2.6.1 儀器精密度試驗 精密吸取0.12 mg/mL的多西環素對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，連續測定6次，峰面積RSD為0.1%，表明有儀器有良好的精密度。

2.6.2 重復性試驗 取同批氟苯尼考注射液(批號20150101，標識生產單位為江西某生物科技有限公司)，按供試品溶液制備項制備樣品溶液，制備6份，分別注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，多西環素平均含量為38.6mg/mL，RSD為0.5%，表明重復性好。

2.7 回收率試驗 取不含多西環素的氟苯尼考注射液(批號150201，山東魯港福友藥業有限公司提供)，每1mL分別添加多西環素15、30、60mg，各平行3份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下進行測定，多西環素平均回收率為99.4%，RSD為0.3%，結果見表1。

表1 回收率試驗

2.8 耐用性試驗

2.8.1 供試品溶液的穩定性 取同一供試品溶液，于制備后0、2、4、6、12、24 h注入液相色譜儀，在上述高效液相色譜條件下分別進行測定，多西環素峰面積的RSD為0.2%，表明樣品溶液在24h內穩定。

2.8.2 色譜條件的微小變動 取同一供試品溶液和對照品溶液，將流動相調整為醋酸鹽緩沖液[0.25mol/L醋酸銨溶液-0.1mol/L乙二胺四醋酸二鈉-三乙胺(100∶10∶1)，調節pH值至8.8]-乙腈(84∶16)、(86∶14)；醋酸鹽緩沖液用冰醋酸或氨水調節pH值至8.7、8.9；柱溫的調整為20℃、30℃；流速調整為0.95、1.05mL/min；記錄色譜圖波長調整為267、271nm，并更換不同廠家的同類型色譜柱分別進行測定，多西環素與氟苯尼考分離效果無明顯差異，多西環素含量的RSD為1.1%，表明色譜條件的微小變動對測量結果無明顯影響。由于柱溫在20℃和30℃多西環素與氟苯尼考分離效果無明顯差異，室溫能滿足檢測要求，故未對柱溫做具體規定。

2.9 判定依據 在相同實驗條件下，供試品色譜圖中如出現色譜峰與相應對照品主峰保留時間一致(差異小于等于±5%)；在200～400nm波長范圍內，供試品出現的色譜峰與相應對照品色譜峰相對峰高大于10%時，兩者光譜圖無明顯差異(必要時可調整供試品溶液的濃度)；最大吸收處波長一致(差異小于等于±2nm)，則判為檢出被測試藥物[6]。供試品色譜圖中如出現與相應對照品保留時間一致的色譜峰，但小于檢出限，判定為未檢出被測試藥物。

檢出限根據氟苯尼考注射液規格不同分別為3.0mg/mL(規格2mL∶1.5g、100mL∶3g)、2.0mg/mL(規格5mL∶1g、10mL∶2g)、1.5mg/mL(規格5mL∶0.75g、10mL∶1.5g)、1.0mg/mL(規格5mL∶0.5g、100mL∶10g)、0.5mg/mL(規格5mL∶0.25g、10mL∶0.5g、50mL∶2.5g、100mL∶5g)。

3 討論與小結

在本研究規定的色譜條件下，多西環素在269和364 nm有最大吸取，前者的吸收強度明顯高于后者，故選擇定量波長為269 nm。

由于需要對被測試藥物優先進行定性判斷，故本研究檢出限以光譜圖失真為依據，與傳統含量測定以信噪比1∶3做為檢出限有所不同，在光譜圖失真時信噪比仍大于1∶10，故未對定量限再做規定。

在依據農業部1934號公告對氟苯尼考制劑中非法添加磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶進行檢測時發現批號20150101，標識生產單位為江西某生物科技有限公司的氟苯尼考注射液色譜圖在磺胺間甲氧嘧啶相近位置出現一色譜峰，但是該色譜峰紫外吸收光譜與磺胺間甲氧嘧啶不一致。該色譜峰紫外吸收光譜與多西環素較為類似且該氟苯尼考注射液為黃色，因此，使用多西環素對照品對比的方式，先確定非法添加物為多西環素，再根據文獻資料對色譜系統進行優化，來實現磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、多西環素的有效分離。

與饒欽雄等[4]建立的飼料中多西環素的毛細管電泳檢測方法相比較，由于氟苯尼考注射液與飼料的基質不同，本方法的前處理方法更為簡單；高效液相色譜法與毛細管電泳法相比雖然試劑消耗量大但是準確度更高、重復性更好，本方法檢測多西環素的平均回收率為99.4%(RSD為0.3%)，遠高于毛細管電泳法的約90%(RSD約為5%)。

常用獸藥大多具有紫外吸收，當它們被用作非法添加時往往能夠通過色譜圖和紫外光譜圖對比的方式檢測出來。如果能夠建立常見藥物的紫外光譜圖庫，正常檢測時打開PDA的3D通道，發現不應有的雜峰時，提取雜峰的紫外光譜圖與圖庫進行匹配，找出疑似添加物，然后選擇合適的標準或建立合適的色譜系統進行色譜圖和紫外光譜圖對比，這樣非法添加的檢測效率就能夠大大提高。

本試驗建立的氟苯尼考注射液中非法添加多西環素檢查方法，簡便、準確度高、重復性好，適用于氟苯尼考注射液中非法添加多西環素的檢測。

[1]UedaYS，htsukiS，NarukawaN，etal．Efficacy of florfenicol on experimental actinobacillus pleuropneumonia in pigs[J]．J Vet Med Sci，1995，57(2)：261-265﹒

[2] Hoar B R，Murray D J．A comparison of the clinical field efficacy and safety of florfenicol and tilmicosin for the treatment of undifferentiated bovine respiratory disease of cattle in western Canada[J]．Can Vet J，1998，39(3)：161-166﹒

[3] 苑 麗，胡攻政，劉智明，等﹒氟苯尼考與多西環素聯合對雞大腸桿菌病的治療效果[J]﹒河南農業大學學報，2005，39(1): 93-97﹒

[4] 饒欽雄，任琳琳，童敬，等﹒飼料中3種四環素類藥物的高效毛細管電泳檢測方法[J]﹒中國畜牧獸醫，2009，36(9): 74-78﹒

[5] 中華人民共和國獸藥典委員會﹒中華人民共和國獸藥典二○一○年版一部[S].

[6] 農業部﹒中華人民共和國農業部公告第1934號[S].

(編輯：陳希)

Establishment of Detection Methods for Doxycycline in Florfenicol Injection

YANG Xiu-zhen1,LI Zan-yang2,XU En-min1,LI Shu-hua1,WANG Yan1,ZHANG Chuan-fa1

(1.ShandongProvincialVeterinaryMedicineSupervisionInstitute;InstituteofVeterinaryDrugQualityInspectionofShandongProvince,Jinan250022,China;2.QingdaocontinentAnimalPharmaceuticalCo.,LTDL,Qingdao,Shandong266111,China)

A detection method of doxycycline illegally adulterated in florfenicol injection was established by HPLC. The isolation was performed on a C18 column(4.6 mm×150 mm，5 μm) with mobile phase consisting of acetate buffer[0.25 mol/L ammonium acetate solution - 0.1 mol/L disodium Edetate solution - triethylamine(100∶10∶1), adjust pH to 8.8] - acetonitrile (85∶15). Photodiode array detector wavelength range was 200～400 nm, The recorded wavelength was 269 nm, The flow rate was 1 mL/min, The injection volume was 10 μL.The results showed that there was a good linear correlation between the peak areas and the concentrations of doxycycline at the range of 0.015～0.96 mg/mL(r=1.0000). The average recovery was 99.4% withRSDof 0.3%(n=9).This method was simple, accurate and feasible . It was suitable for detection of doxycycline illegally adulterated in florfenicol injection.

HPLC; florfenicol injection ; doxycycline

楊修鎮，獸醫師，從事獸藥和畜禽產品質量監督檢驗及科研工作。E-mail: yangxiuzhenaaa@126.com

2015-05-28

A

1002-1280 (2015) 09-0041-04

S859.79