膿毒癥患者血中CD4+CD25+調節性T細胞水平與機體細胞免疫狀態的相關性研究

耿延青

[摘要] 目的 探討膿毒癥患者CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）的水平與細胞免疫的關系。 方法 以2013年7月～2014年6月浙江省溫嶺市第一人民醫院收治的膿毒癥患者53例為觀察組。將觀察組患者按病情分為膿毒癥組（18例）、嚴重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。另選取25名健康者為對照組。用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細胞亞群水平并進行組間比較。 結果 CD4+CD25+Treg表達率：膿毒癥休克組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組，各組間差異有統計學意義（P < 0.05）。CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平：膿毒癥組>對照組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥休克組，各組間差異有統計學意義（P < 0.05）。CD8+水平各組間差異無統計學意義（P > 0.05）。死亡組CD4+CD25+Treg表達率明顯高于存活組（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯低于存活組（P < 0.05）；CD8+水平兩組間差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 膿毒癥患者Treg細胞水平增高，可能導致T淋巴細胞亞群水平降低，在預測患者預后方面有一定作用。

[關鍵詞] 膿毒癥；細胞免疫；CD4+CD25+調節性T細胞

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（c）-0007-05

膿毒癥（sepsis）是感染導致的炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。膿毒癥造成多器官功能衰竭是嚴重創傷患者死亡的主因之一。已往研究認為，膿毒癥是過度炎性反應的一系列綜合征，也就是機體自身滅活病原體的免疫機制被過度激活，導致炎性反應失控，從而引起機體自身損傷，導致多器官功能衰竭甚至死亡。對膿毒癥發病機制的深入探索揭示，除了病原菌及其毒素對正常組織的侵害之外，機體自身免疫功能失衡也在膿毒癥的發病及進展中也起著重要作用[1]。免疫亢進與免疫抑制兩種病理狀態同時存在，加劇了膿毒癥的進展。近年研究發現，機體中存在著CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞）。膿毒癥患者Treg水平升高，從而啟動免疫抑制效應，誘發T淋巴細胞過度凋亡，這正是膿毒癥患者免疫功能紊亂的發生機制[2]。本研究檢測了膿毒癥患者Treg細胞與T細胞亞群水平，分析兩者的相關性及與膿毒癥患者病情與預后的關系，現總結報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年7月～2014年6月在浙江省溫嶺市第一人民醫院（以下簡稱“我院”）治療的膿毒癥患者53例為觀察組。納入標準：符合國際膿毒癥定義會議制訂的診斷標準。排除標準：①患有自身免疫系統疾病；②急性腦卒中；③心肌梗死；④病毒性肝炎；⑤HIV感染；⑥入院前3個月內使用過激素或免疫抑制劑者。入選患者男31例，女22例；年齡31～69歲，平均（58.52±13.46）歲。疾病構成：消化道穿孔破裂術后21例；膽囊壞死及重癥膽管炎12例；腸梗阻術后9例；肺部感染11例。選取25名健康者為對照組，男15例，女10例；年齡32～65歲，平均（56.25±14.62）歲。將觀察組患者按疾病嚴重程度分為膿毒癥組（18例）、嚴重膿毒癥組（21例）、膿毒癥休克組（14例）；按28 d預后情況分為死亡組（16例）和存活組（37例）。

1.2 方法

1.2.1 一般監測指標 監測記錄血乳酸水平、氧合指數；評估急性生理和慢性健康評分（APACHEⅡ評分）。血乳酸水平檢測儀器為美國雅培I-Stat血液分析儀。抽取動脈血1 mL，應用電極法測定血乳酸值。氧合指數通過測定動脈氧分壓后計算得出（氧合指數=動脈氧分壓/吸入氧濃度）。APACHEⅡ評分包括急性生理評分、年齡評分、慢性健康評分三部分，總分0～71分。

1.2.2 試驗指標 符合膿毒癥診斷標準的患者于入選當天采肘靜脈血10 mL，4 h內應用流式細胞儀檢測CD4+CD25+Treg及T細胞亞群水平。另25名例健康者作為對照組同期進行試驗。

試劑與儀器：異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD25單抗，藻紅蛋白（PE）標記的CD4單抗，CD25同型陰性對照試劑，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS試劑（美國Beckman-Coulter公司），細胞膜滲透性試劑盒（美國eBioscience公司）。流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司）。

CD4+CD25+Treg檢測：將25 μL抗凝全血加入試管中，再添加5 μL CD25-FITC與5 μL CD4-PE，混勻并在室溫環境下避光反應15 min，添加500 μL溶血劑，放置于37℃水浴箱中保存10 min，然后上流式細胞儀檢測。T細胞亞群檢測：取100 μL全血，采用全血流式細胞儀三色標記法（直接免疫熒光標記法），確定CD3+、CD4+、CD8+并計算CD4+/CD8+。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般臨床資料比較

不同病情患者各指標比較：血乳酸水平、APACHEⅡ評分，膿毒癥休克組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥組（P < 0.05）；氧合指數，膿毒癥組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥休克組（P < 0.05）。見表1。

不同預后患者各指標比較：存活組血乳酸水平、APACHEⅡ評分低于死亡組（P < 0.05）；存活組氧合指數高于死亡組（P < 0.05）。見表2。

2.2 各組CD4+CD25+Treg表達率與T細胞亞群水平比較

不同病情患者各指標比較：CD4+CD25+Treg表達率，膿毒癥休克組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組（P < 0.05）；CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平，膿毒癥組>對照組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥休克組（P < 0.05）；CD8+各組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

不同預后患者各指標比較：死亡組CD4+CD25+Treg表達率明顯高于存活組（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯低于存活組（P < 0.05）；CD8+兩組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表4。

2.3 各指標相關性分析

膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達率與APACHEⅡ評分呈正相關（r=0.793，P < 0.05）；與血乳酸水平呈正相關（r=0.627，P=0.01）；與CD4+/CD8+呈負相關（r=-0.623，P < 0.05）。

3 討論

3.1 促炎/抗炎反應失衡促進膿毒癥發病的機制

膿毒癥的本質是機體對感染的過度免疫反應。目前認為促炎反應/抗炎反應動態失衡在膿毒癥的發生發展中起重要作用。促炎/抗炎反應過程可分為兩個階段：

第一個階段是炎癥反應綜合征期。此時期的顯著特征是細胞免疫狀態呈增高趨勢，主要為大量產生TNF-α、IL-1β等前炎癥細胞因子，使機體的炎性反應被充分激活，導致單核細胞急劇增殖，同時活性水平增高，分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等細胞因子，誘導抗原性T淋巴細胞活化。TNF-α、IL-1 和 IL-6也是膿毒癥早期的促炎因子，可以通過促進自由基、緩激肽、組胺等產生，激活補體等，加重膿毒癥患者的組織損傷[3]。另外，在膿毒癥患者的促炎反應還表現為前列腺素E2（PGE2）和轉化生長因子-β（TGF-β）合成增多，對機體的免疫功能產生了很大的影響[4]。

第二個階段是代償性抗炎反應期。激發炎癥反應綜合征之后，隨著膿毒癥促炎反應發展，在膿毒癥的后期，機體啟動代償性抗炎反應，進入免疫抑制狀態，嚴重者甚至出現免疫麻痹，其典型表現是CD4+ T淋巴細胞以及B淋巴細胞不斷出現凋亡，而且增殖能力明顯降低，其造成的免疫抑制是膿毒癥病理生理機制的關鍵環節，使機體對病原體的易感性明顯增加。同時，在機體的負向調控機制中，細胞因子也發揮了重要的作用。IL-10是由多種細胞（如單核細胞、T細胞、B細胞、肥大細胞等）分泌的抗炎細胞因子，是機體重要的免疫調節因子，作為抗炎因子主要對單核/巨噬細胞發揮影響，抑制巨噬細胞的黏附、激活。隨著IL-10等抗炎細胞因子水平升高以拮抗過度產生的前炎癥細胞因子，而前炎癥細胞因子水平明顯降低，導致機體免疫功能低下，尤其是抗感染的功能嚴重受損，成為病情進一步惡化的主要原因。研究證實，IL-10水平升高被認為與膿毒癥時免疫功能紊亂相關[5]。有報道顯示，應用相應的抗原和IL-10反復刺激可以抑制細胞因子，誘導特異性調節性T淋巴細胞增殖、克隆，從而發揮免疫抑制作用。

3.2 Treg細胞對膿毒癥免疫功能的影響

在動物和人類膿毒癥患者中，均被證實發生了大量CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞凋亡。秦慶華[6]指出，大約1/2由于膿毒癥致死的患者表現為淋巴細胞的凋亡增加，雖然未發現CD8+T淋巴細胞等的數量出現明顯減少，但CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞濃度均顯著降低。由于淋巴細胞的大量凋亡，使活化的T淋巴細胞不斷被清除，這誘導了T淋巴細胞的克隆無反應性，導致其對抗原刺激失去反應，無法對抗病原體的侵襲，并且分泌細胞因子的能力也明顯受到抑制。伴隨著淋巴細胞大量凋亡的還有樹突狀細胞，后者是功能最強的抗原遞呈細胞，其凋亡使細胞的抗原遞呈能力明顯受損，進而引起CD4+T淋巴激活功能障礙，進一步加劇了機體的免疫功能異常反應。

CD4+CD25+Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠體內發現的，其在正常人和小鼠外周血CD4+T細胞中的含量占1%～2%，主要特征性表達CD25（IL-2受體的A鏈），具有分泌IL-10與PGE2的功能，是一類重要的免疫抑制細胞，廣泛參與多種免疫調節機制。近年來較多研究表明，CD4+CD25+Treg在膿毒癥復雜的免疫調節中發揮著對細胞免疫的抑制作用，可影響機體的天然免疫和獲得性免疫。盛志勇等[7]認為，膿毒癥患者機體的免疫反應傾向于Th2型，Th2型細胞因子生成增多而Th1型細胞因子產生減少，明顯損害了機體的細胞免疫功能。Treg可以抑制CD4+/CD8+T淋巴細胞功能，介導Th1向Th2反應漂移，調節促炎、抗炎介質水平，下調樹突狀細胞表面共刺激分子的表達，影響免疫細胞如單核巨噬細胞、中性粒細胞的凋亡和增殖，特別是誘導T淋巴細胞的凋亡[8]。研究表明，Treg細胞水平與膿毒癥的發病存在密切關系，膿毒癥發病時Treg水平明顯升高。在膿毒癥患者中，CD4+CD25+Treg升高在死亡者中多見，提示CD4+CD25+Treg在某種程度上能夠表現膿毒癥患者病情的嚴重程度，能夠為預測患者的預后提供依據[9]。Zhang等[10]從基因水平證實上述結論，其研究發現，膿毒癥患者Treg細胞的特異性標志Foxp3 mRNA明顯增多。Hein等[11]研究報道膿毒癥患者Treg水平與ASPs Ⅱ及乳酸水平存在負相關。

本研究結果顯示，CD4+CD25+Treg表達率：膿毒癥休克組>嚴重膿毒癥組>膿毒癥組>對照組；膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明顯高于對照組，嚴重膿毒癥組和膿毒癥休克組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+則顯著下降。相關性分析表明：膿毒癥患者CD4+CD25+Treg表達率與APACHEⅡ呈正相關，與乳酸水平呈正相關，與CD4+/CD8+呈負相關。T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+是機體的免疫功能狀態的重要指標。Inoue等[12]研究發現，采用干預措施減少CD4+和CD8+的凋亡，能夠改善膿毒癥的生存率。這說明隨病情加重，膿毒癥患者Treg水平呈上升趨勢，從而加劇免疫無反應狀態。有關Treg誘導淋巴細胞凋亡的機制，可能有以下多種不同的途徑：①IL-2是細胞增殖信號，在T淋巴細胞增殖過程中起著重要的激活作用。Treg細胞上的CD25能夠與效應細胞競爭結合IL-2，使IL-2無法正常發揮增殖信號功能[13]。②Treg細胞能夠誘導IL-10水平的升高，從而發揮免疫抑制效應。③Treg細胞能夠激活FAS和FASL，通過Caspase級聯反應，誘發T細胞彼此殺傷或直接凋亡。④Treg細胞經TCR介導的信號刺激活化后，能導致免疫亢進轉向免疫抑制。隨著膿毒癥病情的加重，Treg數量增加，免疫抑制加劇，最終導致患者免疫麻痹，甚至死亡。已有研究表明，通過使用胸腺肽，誘導和促進T淋巴細胞的分泌與成熟，能夠有效提高IL-2的活性及受體表達水平，從而對膿毒癥的免疫抑制產生刺激作用，逆轉其免疫抑制狀態，尤其是對于輕中度的免疫抑制狀態能夠通過上述治療取得良好效果，而重度免疫抑制者經過較長時間持續治療也能夠獲益[14]。進一步證明免疫抑制的形成與改善是影響患者預后的重要因素。

綜上所述，臨床上對膿毒癥患者檢測Treg水平能夠反映患者的細胞免疫狀態，對患者的預后有一定預測作用。但由于目前相關的臨床研究還較少，其確切的調控機制還有待進一步深入探討。由于膿毒癥患者的免疫失衡涉及各種細胞因子及炎癥介質，而且與神經、內分泌因素的調節作用存在密切關系，因此，僅分析某幾種細胞或細胞因子的相關性，不可能全面了解其根本的發病機制。隨著對Treg細胞的免疫調節功能認識的日益深化，對膿毒癥的臨床干預的切入點將會越來越多，從而為防治膿毒癥及其他感染性疾病提供可靠的新手段。

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（收稿日期：2014-09-30 本文編輯：程 銘）