補腎壯骨丸抗骨質疏松的藥效學作用及機制探討

邢爽++++++康學

[摘要] 目的 探討北京積水潭醫院院內制劑補腎壯骨丸抗骨質疏松的藥效學作用及其機制。 方法 6個月齡雌性SD大鼠60只，隨機分為正常對照組、模型對照組、補腎壯骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）劑量組以及陽性藥雷洛昔芬組，每組10只。雙側卵巢摘除術建立大鼠骨質疏松模型，去勢手術1周后，補腎壯骨丸低、中、高劑量組及陽性藥組分別灌胃給予不同劑量補腎壯骨丸混懸液及雷洛昔芬混懸液治療12周，正常及模型對照組灌服等體積的生理鹽水。分別檢測血清堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、甲狀旁腺激素（PTH）、促甲狀腺激素（CT）以及垂體-性腺軸相關激素雌二醇（E2）、睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）含量；測定骨密度、骨生物力學性能。 結果 去勢后，模型對照組血清ALP、TRAP、PTH活性顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），含量分別為（16.347±2.957）U/100 mL、（27.691±7.042）U/L、（45.829±17.007）pg/mL，CT水平顯著下降，含量為（20.469±7.343）pg/mL，全股骨和股骨頭骨密度為（0.1859±0.0137）、（0.1871±0.0193）g/cm2，股骨最大載荷為（63.448±17.540）N，最大撓度為（0.5848±0.1595）mm，均較正常對照組顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）；性激素E2和T含量顯著降低（P < 0.01），分別為（5.935±1.621）pg/mL、（3.382±1.405）ng/mL，促性腺激素LH和FSH水平明顯上調（P < 0.05），含量分別為（12.549±2.376）、（15.841±1.896）mU/mL；與模型對照組比較，補腎壯骨丸中、高劑量組ALP含量為（13.619±2.881）、（12.720±3.044）U/100 mL，TRAP含量為（20.904±6.454）、（19.933±5.988）U/L，PTH含量為（26.753±13.013）、（25.630±15.618）pg/mL，三者活性均顯著下調（P < 0.05或P < 0.01）；高劑量組CT含量顯著升高，為（28.350±7.827）pg/mL，中、高劑量組全股骨密度及高劑量組股骨頭密度顯著升高，分別為（0.2081±0.0113）、（0.2135±0.0139）、（0.2304±0.0290）g/cm2，高劑量組股骨最大載荷及撓度分別為（81.314±16.413）N、（0.7358±0.1488）mm，較模型組顯著升高（P < 0.05）；高劑量組E2、T顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），含量為（8.799±2.204）pg/mL、（5.086±1.668）ng/mL；中、高LH含量分別為（10.740±1.652）、（10.575±0.886）mU/mL，FSH含量分別為（13.244±2.089）、（13.348±2.170）mU/mL，二者水平均顯著下調（均P < 0.05）。 結論 補腎壯骨丸可有效糾正骨代謝異常，增加骨密度，增強生物力學性能，其發揮抗骨質疏松作用的部分機制與其調節垂體-性腺軸相關激素水平有關。

[關鍵詞] 骨質疏松；去勢；補腎壯骨丸；藥效及機制研究

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（c）-0024-05

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨質量降低，骨組織纖維結構退化，繼而引發骨骼脆性及骨折危險性增加為特征的系統性骨病，該病已躍居世界常見病發病率的第7位[1]，由OP引起的嚴重的醫療和社會負擔，已成為全球公共衛生問題。由于骨屬于雌激素依賴性組織，因而絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）在原發性OP中占有很大比例。目前西藥治療現狀并不理想，而中醫藥著重辨證論治，在防治該病方面顯現出較大的優勢。無論OP還是PMOP均屬于中醫“骨痿”范疇，中醫認為其發生首先當責之于腎精虧虛[2]，故補腎填精壯骨是治療該病的根本大法。補腎壯骨丸是北京積水潭醫院（以下簡稱“我院”）院內制劑，具有補腎填精、強筋壯骨之功，正切合PMOP之腎虛精虧的中醫發病病機。本實驗通過去勢建立經典的大鼠骨質疏松模型，探討補腎壯骨丸抗OP的藥效學作用及其機制，為該制劑的進一步臨床應用提供可靠的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Biofuge 15R低溫生物離心機（德國Heraeus SEPATECH公司）；UV-1700型分光光度計（日本島津公司）；CP224C型萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；R-911型全自動放免儀（中國科技大學實業總公司）；尼康ECLIPSE 80i型生物顯微鏡附圖像分析軟件（銳馳恒業儀器科技有限公司）；Lexxos-2000型雙能X射線骨密度儀（法國MEDILINK公司）；WD-1型電子萬能試驗機（長春非金屬試驗機廠）；萊卡RM2235型切片機（上海萊卡儀器有限公司）；Multiskan MK3型全自動酶標儀（美國THERMO公司）。

1.2 動物

清潔級6個月齡健康雌性SD大鼠60只，由北京維通利華實驗動物技術股份有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2013-0001。

1.3 藥品與試劑

藥品：補腎壯骨丸（北京積水潭醫院院內制劑，京藥制字Z20053696，批號：140412，規格：每100粒重20 g）；雷洛昔芬片（商品名：易維特，禮來制藥有限公司，批號：L02576，每片重0.2585 g，相當于以C28H27NO4S·HCl計60 mg）；戊巴比妥鈉（天津市光復精細化工研究所，批號：20120527）。

試劑：堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：20130925、20131021）；甲狀旁腺激素（PTH）、促甲狀腺激素（CT）酶聯免疫試劑盒（美國BG公司，批號E02P0572、E02C0404）；睪酮（T）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）放免測試盒（北京華英生物技術研究所，批號分別為：20131125T、20131205E、20131130L、20131129L）。

2 方法

2.1 分組

60只大鼠按隨機數字表法分為6組，每組10只。包括正常對照組、模型對照組、補腎壯骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）劑量組、雷洛昔芬組。自由飲水、攝食。

2.2 造模

施行手術造模法，術前8 h禁食，在無菌條件下，各組大鼠均用1%戊巴比妥鈉（40～50 mg/kg）腹腔內注射麻醉，腹腔正中切口。除正常對照組外，各組大鼠均行雙側卵巢摘除術；正常對照組用同樣手術入路暴露卵巢，切除少量脂肪，不摘除卵巢。術后每只大鼠給予青霉素鈉鹽5 U/d，連續用3 d。

2.3 給藥

去勢手術1周后，各組動物灌胃給予相應的藥物或生理鹽水，每日1次，連續給藥12周。① 補腎壯骨丸低、中、高劑量組：分別給予補腎壯骨丸混懸液1.2、2.4、4.8 g/kg體重灌胃（中劑量組用量相當于臨床等效劑量）；②雷洛昔芬組：雷洛昔芬片6.25 mg/kg體重灌胃；③正常對照組、模型對照組：灌服與用藥組等體積的生理鹽水。

2.4 取材及檢測

禁食16 h后，腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒說明書，比色法檢測血清ALP、TRAP含量，酶免法檢測血清PTH、CT含量，放免法檢測血清E2、T、LH、FSH水平。分離大鼠的左右兩側股骨，剝除其附著的肌肉及結締組織，左側用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹置于-20℃保存，用于骨密度以及生物力學檢測；右側以10%甲醛溶液固定，行病理組織形態計量學檢測。

2.5 統計學方法

采用SPSS 17.0 for Windows軟件包完成。符合正態分布的數據采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane′s T2（方差不齊）進行數據分析；非正態分布的數據采用非參數檢驗方法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清ALP、TRAP含量的比較

與正常對照組比較，模型對照組血清ALP、TRAP含量均顯著升高（均P < 0.01）。與模型對照組比較，補腎壯骨丸中、高劑量組以及陽性藥雷洛昔芬組二者水平均顯著降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

3.2 各組大鼠血清PTH、CT含量的比較

與正常對照組比較，模型對照組血清PTH含量顯著升高（P < 0.01），CT含量顯著下降（P < 0.05）。補腎壯骨丸各劑量組及雷洛昔芬組PTH水平顯著降低（均P < 0.01）；僅補腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組可顯著升高血清CT含量（均P < 0.05）。見表2。

3.3 各組大鼠骨密度的比較

各組大鼠骨密度掃描結果顯示：模型對照組全股骨及股骨頭處骨密度均較正常對照組顯著降低（均P < 0.01）。經治療后，補腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組兩處骨密度均明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），中劑量組僅能顯著增加全股骨骨密度（P < 0.01）。見表3。

3.4 各組大鼠骨生物力學性能的比較

生物力學測試結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組股骨最大載荷量及最大撓度均明顯下降（P < 0.05或P < 0.01）。補腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組能顯著提高股骨最大載荷及最大撓度（均P < 0.05）。見表4。

3.5 各組大鼠垂體-性腺軸相關激素水平的比較

性腺軸相關激素水平檢測結果顯示：造模后，大鼠血清E2、T含量均顯著下降（均P < 0.01），而促性腺激素LH和FSH水平顯著上調（均P < 0.05）。與模型對照組比較，補腎壯骨丸中、高劑量組及雷洛昔芬組血清E2含量顯著升高（P < 0.05或P < 0.01），僅高劑量能顯著提高血清T含量；補腎壯骨丸中、高劑量組及雷洛昔芬組血清LH、FSH水平較模型對照組顯著下調（均P < 0.05）。見表5。

4 討論

OP是老齡化社會衛生保健的一個突出問題，得到了世界各國醫學界的普遍重視。其中，最為常見且比例較大的PMOP是由于絕經后雌激素水平驟減，導致骨吸收大于骨形成，出現以低骨量和骨組織結構退行性病變的全身代謝性骨病[3]。據調查，OP患病率女性是男性的2.73倍，尤其絕經后激素水平急劇下降，OP發病率顯著升高，且年齡每增加10歲，OP患病風險增加1.4～1.8倍[4]。因此，有效防治這一高發性骨病，篩選開發出安全高效的抗OP新藥物是現代醫學亟待解決的重要問題。

西醫用藥主要是針對發病的病理環節，采用補充雌激素、骨吸收抑制劑、骨形成促進劑等，這種單點局限治療對于OP這一復雜病變難奏長效，加之治療費用高、副作用較大及其潛在的致癌性[5-6]，使其應用受到限制，故治療現狀尚不理想。中醫藥治療著重調動內因、辨證論治，最終達到糾正機體激素失衡和負鈣平衡的功效。中醫學將該病歸屬于“骨痿”、“骨痹”范疇，認為五臟虛損和氣血功能紊亂與PMOP發病密切相關，腎虛、脾虛、血瘀等為基本病機，其中腎虛精虧是核心病機[7]，正如《素問·痿論》云：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”，尤其絕經伴隨年齡的增長到“女子七七天癸竭”，腎中精虧髓虛，骨髓生源不足，不能濡養骨骼，則發為腰膝酸軟、行走不便的“骨痿”?，F代醫學認為，腎精相當于性激素及促性腺激素，與垂體-性腺軸系統作用有驚人的相似之處[8]。由此可見，“腎虛精虧、天癸竭”中醫病機與現代醫學認為雌激素缺乏是PMOP的首要病因這一理論是相吻合的。因此，補腎填精壯骨之法是治療PMOP的根本大法。

北京積水潭醫院院內制劑補腎壯骨丸主要由補骨脂、鹿角霜、龜甲、牛膝、三七、土鱉蟲等組成，具有補腎填精，強筋壯骨，益氣活血的功效，用于腎虛腰背酸痛，足膝軟弱，疲倦乏力，畏寒肢冷，自汗，盜汗，五心煩熱等癥及骨質疏松等。本研究通過骨代謝生化以及直觀評價OP的指標來評價補腎壯骨丸抗OP的藥效學作用，并以性激素缺乏是PMOP的首要病因這一理論以切入點，通過研究垂體-性腺軸相關激素水平的變化，探討藥物防治OP的作用機制，以期更好地為該制劑的臨床應用提供依據。

骨代謝生化指標可動態觀察骨轉換代謝過程，對評價骨質量、監測藥物療效有著重要意義。ALP是成骨細胞分化的早期標志物，血ALP可作為評價骨形成能力和骨轉換率的特異性生化指標，其活性在破骨或成骨占優勢時均升高[9]。TRAP由破骨細胞分泌釋放，血清中TRAP的水平可以反映體內OC活性和骨吸收狀態[10]。本研究結果顯示：大鼠去勢后，血清ALP和TRAP水平均顯著升高，提示骨代謝處于骨吸收大于骨形成的負平衡狀態，補腎壯骨丸可明顯下調二者水平，提示該制劑能夠有效逆轉高轉換型骨代謝狀態，從而使骨吸收和骨形成之間的偶聯趨于平衡。PTH和CT是調節機體鈣磷代謝和骨組織新陳代謝的重要激素。血PTH對骨的作用是通過刺激破骨細胞活性來促進骨吸收[11]。本研究中經藥物干預后大鼠血PTH含量明顯降低，CT水平顯著升高，說明補腎壯骨丸能通過抑制機體PTH水平來抑制骨吸收，通過影響鈣調節激素PTH和CT的水平來改善骨代謝進而防止OP。

聯合直觀反映OP的藥效學指標能夠更全面、合理地評價骨轉換狀態以及藥物干預治療效果。骨密度已被看作是臨床診斷OP的“金標準”；骨生物力學性能是決定骨強度和對脆性骨折風險進行評定的可靠方法[12]；此外，OP的主要病理表現是骨組織顯微結構的異常，因此，骨組織病理形態可作為直觀反映骨量評價骨轉換與骨結構不可或缺的關鍵性指標[13]。本研究結果顯示：造模后，OP大鼠骨密度顯著下降，股骨最大載荷和撓度均明顯降低，且顯微結構出現典型的骨質疏松樣改變；補腎壯骨丸干預治療后，上述指標均明顯改善，提示該制劑可通過增加骨密度，增強結構力學性能，逆轉骨組織病理樣改變而發揮抗OP作用。

由于雌激素水平驟減，造成破骨細胞活性明顯增強，骨轉換加快已是公認的PMOP發生的首要原因。中醫所言的“腎虛精虧”與該理論相吻合，故因此為切入點來探討藥物作用的可能機制。雄激素可刺激成骨細胞和骨細胞的增殖、分化，其減少與骨丟失相關；雌激素在骨吸收方面起主導作用，其含量下降可導致骨轉換活躍和骨密度降低[14]。此外，垂體-性腺軸各個水平的激素之間都存在著紐帶聯系，上游激素FSH和LH可作用于性腺，調節性激素的生成、釋放，同樣會被性激素反饋性抑制[15]。本研究顯示：行去勢術后，OP大鼠雌雄激素水平驟減，促性腺激素分泌反饋性異常升高，提示性激素水平低下及相關激素分泌紊亂是導致骨代謝異常的重要原因之一。經補腎壯骨丸治療后能顯著提高性激素水平，糾正促性腺激素的異常分泌，提示垂體-性腺軸相關激素水平的整體調節作用可能是該制劑防治OP的作用機制之一。

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（收稿日期：2014-11-02 本文編輯：衛 軻）