柱前衍生高效液相色譜測定糖化血紅蛋白

王冬環，周偉燕，張天嬌，汪　靜，馬　嶸，張江濤

(北京醫院 衛生部臨床檢驗中心，北京100730)

柱前衍生高效液相色譜測定糖化血紅蛋白

王冬環*，周偉燕，張天嬌，汪靜，馬嶸，張江濤

(北京醫院 衛生部臨床檢驗中心，北京100730)

摘要：目的建立一種柱前衍生高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測定糖化血紅蛋白(HbA1c)的方法。方法蛋白內切酶 Glu-C 將血紅蛋白從β鏈N末端水解得到糖基化和非糖基化的六肽(HbA1c六肽和HbA0六肽)，HbA1c六肽和HbA0六肽與對氨基苯磺酸進行衍生反應，生成糖基化和非糖基化偶氮六肽衍生物，采用高效液相色譜對衍生物進行分離、測定，根據HbA1c衍生六肽和HbA0衍生六肽的峰面積比計算樣本中HbA1c的量。結果對高、中、低不同濃度血樣進行反復多次分析，總變異系數CV分別為1.61%、1.74%和0.90%；HbA1c濃度在0.3% -15.6%范圍內，線性回歸方程為Y=1005X+7.26，R=0.995 9，線性關系良好；對低、中、高3個濃度的HbA1c國家有證標準物質(GBW09181、GBW09182和GBW09183)進行測定，測定值與認證值的偏差在-3.81%-3.53%之間。采用本研究方法和常規方法分別對20份人血樣本進行測定，相關回歸方程為Y=0.928X+0.407，相關系數為R=0.996 5，二者有良好的相關性。 結論建立了柱前衍生HPLC測定HbA1c的方法，本法具有很好的穩定性、精密度和準確性。

關鍵詞：血紅蛋白A，糖基化；肽；柱前衍生；色譜法，液相

(ChinJLabDiagn,2015,19:1991)

糖尿病已成為21世紀全球范圍的流行病。2014年全球糖尿病患者數為3.87億，預計2030年將達到5.92億[1]。而我國就有1.139億，居世界首位，此外，還有50%的中老年人是糖尿病后備軍[2]。 糖尿病是視網膜、腎臟、足及神經病變的主要危險因素，更是缺血性心臟病和中風的獨立風險因子[3]，嚴重威脅患者的生存質量以及生命[4]。糖化血紅蛋白(HbA1c)是世界衛生組織及國際專家委員會推薦的糖尿病診斷標準[5]，是糖尿病血糖控制的“金標準”[6],也是評估糖尿病微血管、大血管并發癥的重要指標[7,8]。HbA1c可以反映最近2-3個月的平均血糖水平,與傳統的糖尿病診斷指標相比，具有樣本穩定、個體內生物學變異小、抽血時間不受限制、不易受干擾等優點，是糖尿病診斷、篩查和管理的有效指標[9]，因此，保證糖化血紅蛋白測定結果的準確性為臨床提供可靠的依據至關重要。

HbA1c的常規測定方法有多種，尤其在我國，多達幾十種，由于采用的原理與技術不同，因此測定結果的可比性和準確性有待提高。HbA1c測定有國際公認的參考方法，是國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine，IFCC)建立的高效液相串聯電噴霧電離一級質譜(或高效液相串聯毛細管電泳，兩個方法結果一致)參考測量程序[10]，并推薦使用mmol/mol為HbA1c的單位[11]。由于IFCC推薦的HbA1c參考測量程序采用一級質譜，使用氰基柱，在精準性方面有些不足。德國學者對此進行了改良，增加流動相中三氟乙酸的濃度并改變了洗脫梯度，解決了峰脫尾的問題并有效地改善了峰形，穩定了保留時間，提高了分析精密度[12]，但同時增加了質譜分析響應信號的離子抑制風險[13,14]和質譜的污染；還有學者采用C12柱替代氰基柱[15]，但以上兩種改進都需要配備轉向閥和輔助泵，增加了實驗成本。

我們實驗室已經建立了IFCC 推薦的LC-MS/MS測定HbA1c參考測量程序，現為IFCC網絡參考實驗室，考慮到質譜測定操作復雜，測定成本高昂，所需校準品運輸困難，根據我們檢測HbA1c的有關經驗，利用HbA1c是糖基化血紅蛋白與血紅蛋白的比值及組成血紅蛋白的活性氨基酸可以衍生的特點，探討了一種柱前衍生高效液相色譜測定HbA1c的方法，現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1有證標準物質6個濃度水平的HbA1c國際基準校準物質Pcal2012-A-Pcal2012-F(認證值分別為：0.0 mmol/mol，29.3 mmol/mol，58.7 mmol/mol，87.5 mmol/mol，117.4 mmol/mol，146.9 mmol/mol，IFCC，比利時)；3個濃度水平的HbA1c國家標準物質GBW09181- GBW09183(認證值分別為：38.4 mmol/mol (5.67%)、52.7 mmol/mol (6.97 %)、88.7 mmol/mol (10.27 %)，中國)。

1.1.2試劑蛋白內切酶 Glu-C(美國NEB公司)，色譜純合成HbA1c六肽及HbA0六肽(上海科肽公司)，色譜純乙腈(美國Fisher公司)，β嗎啉乙磺酸(德國Sigma公司)，氯化鈉﹑醋酸銨﹑對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、氯化銨、磷酸二氫鈉和氫氧化鈉分別為進口和國產分析純試劑。

1.1.3儀器Ultimate 3000系統(美國Dionex公司)，3K15離心機(德國Sigma公司)，282A真空干燥箱(美國Fisher公司)，恒溫振蕩器(型號Unimax1010，德國Heidolph公司)，天平(型號XPE105，瑞士Mettler公司)，HLC-723 G7 糖化血紅蛋白檢測儀及配套試劑(日本Tosoh公司)。

1.1.4血液樣本 2014年北京醫院內分泌科住院、門診患者及志愿者的EDTA抗凝全血樣本，其中，男23例，女16例，年齡23-68歲，平均年齡48.3歲。

1.2樣品處理及測定

1.2.1衍生試劑配制A液：稱取0.09 g對氨基苯磺酸，加入濃鹽酸0.9 ml，加水至10 ml，超聲至完全溶解，再與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液混合置棕色瓶中，放入冰箱1 h后使用；衍生B液為10%的硝酸鈉溶液；氯化銨-氨水緩沖液：稱取0.8 g氯化銨，置于燒杯中，加水溶解，用12 mol/L濃氨水調pH 至9.6，置于100 ml容量瓶中，定容至刻度。

1.2.2樣品前處理方法

①溶血液的制備及酶解1.5 ml EDTA抗凝全血，于8 ℃ 3 000 g離心10 min，除去上層血漿；向下層紅細胞中加入10 ml 0.15 mol/L 氯化鈉溶液，置37 ℃溫浴4 h，離心20 min，棄去上清液，重復該步驟，清洗紅細胞2次；加入等體積超純水，混勻；離心20 min，棄去沉淀物，小心吸取上層溶液，加入10 ml含穩定劑的水溶液(50 mmol/L β嗎啉乙磺酸、10 mmol/L 碳酸氫鈉，1 mmol/L Na2-EDTA，pH 6.2)，混勻，制成溶血液，待用。取30 μl溶血液于玻璃安瓿中，加入50 μl 200 μg/ml Glu-C內切酶溶液，再用消化液(50 mmol/L醋酸銨，pH 4.3)將體積補足到500 μl，置(37±2)℃恒溫振蕩器18 h取出，-20 ℃冰箱停止消化，得到HbA1c六肽和HbA0六肽，待衍生用；6個濃度的HbA1c國際基準校準物質Pcal2012-A- Pcal2012-F及3個濃度的HbA1c國家標準物質GBW09181- GBW09183同步進行酶解消化。

②HbA1c六肽﹑HbA0六肽衍生化在1 ml氯化銨-氨水緩沖液中，先加入0.5 ml酶解液樣品，然后分別加入1 ml衍生A液、1 ml衍生B液，搖勻，置于室溫，反應20 min，進行HPLC分析。

1.2.3HPLC分析條件所用色譜柱為Zorbax Eclipse C18柱(4.6 mm*150 mm，粒徑5 μm，美國Agilent公司)。柱溫：25℃，流速：1.0 ml/min，進樣量：20 μl，流動相A液：0.015 mmol/L 磷酸二氫鈉，流動相B液：乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　液相色譜梯度洗脫程序

1.3方法性能評價

1.3.1精密度用低、中、高3個濃度的血樣(HbA1c濃度分別為5.5%，6.8%和10.7%)考察本方法的精密度，用本法測定3批樣本，每批每個濃度測3個平行樣，每個平行樣重復進針3次，將3次結果的平均值作為1個平行樣的結果，這樣，每個樣品可得到9個測定結果，以批內CV和總CV表達本方法的精密度。

1.3.2特異性為檢驗本方法的特異性，首先取1份混合EDTA抗凝血樣，分為3份，1份樣本不做處理，另外2份樣本分別進行甲酰化處理和乙酰化處理，然后分別用本方法和常規離子交換-高效液相色譜對3份樣品進行處理和檢測，比較樣本處理前后的結果有無差異，以驗證方法的特異性。樣本的甲酰化處理：在1份樣本中加入2 mmol/l 氰酸鉀，置于37℃溫育1 h；樣本的乙酰化處理：在1份樣本中加入5 mmol/l 乙酰水楊酸，置于37℃溫育1 h。

1.3.3線性范圍分析6個濃度水平的國際基準校準物質Pcal2012-A-Pcal2012-F，以HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽峰面積比對相應的HbA1c認證值作線性回歸，得到回歸方程，以確定本方法的線性范圍。

1.3.4準確性用本法對3個濃度水平的國家有證標準物質GBW09181- GBW09183進行測定，每個濃度測定3批，每批測定3個平行管，每個平行管重復進針3次，以每個濃度的平均結果與認證值進行比較，評價方法的準確性。

1.3.5與常規方法比對選取覆蓋HbA1c高、中、低濃度范圍共20份EDTA抗凝人血樣本，分別用本方法、常規方法進行檢測。常規方法采用Tosoh G7 糖化血紅蛋白檢測儀，檢測時嚴格按照標準操作程序進行，采用儀器配套校準品為儀器校準。以本方法所測結果與常規方法所測結果做線性回歸，進行比對。

1.3.6測量原理及數據統計蛋白內切酶Glu-C將血紅蛋白β鏈N末端第6個氨基酸殘基水解，得到糖基化和非糖基化六肽，即：HbA1c六肽﹑HbA0六肽；將HbA1c六肽與HbA0六肽衍生生成HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽，用HPLC分離、定量。HbA1c在樣品中的含量可根據HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比計算得出，計算公式如下：

C =100* Ratiosig/(1+Ratiosig)

式中：C為HbA1c濃度(單位：%)，Rsig為樣品中HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比。

采用微軟Excel 2007進行數據統計，相關分析采用線性回歸和線性相關檢驗。

2結果

2.1樣品處理

本方法的樣品處理主要由2部分組成，第一部分的溶血液制備及酶解主要目的是獲得短肽，以便于分析、測定，經過Glu-C內切酶的水解作用，血紅蛋白在β鏈N末端第6個氨基酸殘基(Glu)處斷開，得到糖基化HbA1c六肽和非糖基化HbA0六肽，即：C4H9O4-CO-CH2-NH-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH和NH2-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH。第二部分衍生，HbA1c六肽和HbA0六肽片段N端第二位是組氨酸殘基(His)，組氨酸的咪唑基與對氨基苯磺酸發生衍生化反應，生成橘紅色偶氮產物，即：HbA1c衍生六肽和HbA0衍生六肽。

2.2HPLC測定條件的選擇

為獲得更好的色譜分離信號，本方法主要對所用色譜柱、柱溫、進樣量、流動相的組成、流動相的比例、流速等條件進行了優化，最終選擇色譜柱為Zorbax Eclipse C18柱，(4.6 mm*150 mm，粒徑5 μm，美國Agilent公司)。柱溫為25℃，進樣量為20 μl，流動相為0.015 mmol/L 磷酸二氫鈉：乙腈，流速為1.0 ml/min。分析色譜圖見圖1。

圖1　HbA1c衍生六肽及HbA0衍生六肽色譜圖

2.3精密度

低、中、高3個濃度水平血樣的HbA1c濃度分別為S1：4.70%，S2：6.95%和S3：9.06%，對應的批內CV和總CV分別為S1：0.51%，1.61%；S2：0.75%，1.74%；S3：0.38%，0.90%，本方法精密度良好。

2.4特異性

采用本方法和常規離子交換-高效液相色譜法檢測不做任何處理樣本的結果分別為6.6%，6.8%；對應的經過甲酰化處理樣本的結果分別為6.6%，7.1%；經過乙酰化處理樣本的結果分別為6.6%，7.3%。由此可見，血紅蛋白的甲酰化和乙酰化對離子交換-高效液相色譜法有影響，而本方法在樣本處理前后檢測結果一致，說明本方法有很好的特異性。

2.5線性范圍

6個濃度水平的國際基準校準物質Pcal2012-A-Pcal2012-F 認證值分別為：0.0 mmol/mol，29.3 mmol/mol，58.7 mmol/mol，87.5 mmol/mol，117.4 mmol/mol，146.9 mmol/mol ，以HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比對相應的認證值作線性回歸，回歸方程為：y=1005x+7.26(R2=0.992)，由此可見本方法的線性范圍至少為7.26 mmol/mol-146.9 mmol/mol，也可換算為0.3%-15.6%HbA1c[16]，本方法線性范圍能夠滿足臨床應用的需求。

2.6準確度

用本法對3個濃度水平的國家有證標準物質GBW09181- GBW09183進行測定，每個濃度測定3批，每批測定3個平行管，每個平行管重復進針3次，測定結果的均值分別為：5.58% HbA1c，7.01% HbA1c，10.46% HbA1c，與認證值的偏差分別為：-0.09%，-0.04%，0.19%，對應的偏倚分別為-3.81%，0.96%，3.53%。

2.7與常規方法比對

選取覆蓋高、中、低濃度范圍的20份EDTA抗凝人血樣本，分別用本方法、常規方法進行檢測。以本方法所測結果對常規方法所測結果做線性回歸，回歸方程為y=0.928x+0.407，相關系數R2=0.993，顯示二者有良好的相關性。

3討論

本研究主要基于以下2個特點進行實驗設計與研究：①利用HbA1c定義為糖基化血紅蛋白與血紅蛋白比值的特點，根據HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的峰面積比計算得出HbA1c的量；②利用血紅蛋白的活性氨基酸可以進行衍生化反應的特點，以提高液相色譜分析的分離率與靈敏度。

多肽是一類具有重要生物功能的化合物，不僅是蛋白質和氨基酸之間的橋梁，也是蛋白質測序中能夠直接測定的對象，與其它氨基酸相比，組氨酸常為活性中心，組氨酸殘基的咪唑基可與對氨基苯磺酸進行衍生化反應，生成棕紅色的偶氮化合物，即Pauly反應。血紅蛋白由氨基酸組成，其β鏈N末端第2個氨基酸殘基恰為組氨酸，本研究將血紅蛋白水解為六肽，并與對氨基苯磺酸進行衍生化反應，由于氨基酸的衍生實驗具有操作簡潔、不產生或易于排出干擾物、色譜分離率高、靈敏度高等優點[17]，可增加HPLC分析、測定HbA1c的精密度與特異性。

本研究中色譜條件是定量HbA1c的關鍵環節，為此對色譜條件進行了詳細的優化，最終確定了本方法的條件。在色譜條件優化過程中，使用了合成HbA1c六肽與HbA0六肽，對合成六肽進行衍生化反應后，根據合成HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽的分離條件及吸收峰位置確定色譜條件。在應用本方法時，流動相的配制是整個實驗是否成功的關鍵所在。首先，在稱量磷酸二氫鈉時，稱量誤差不能大于0.020 g；另一個關鍵問題是，精確調節流動相的pH，pH對本方法HbA1c衍生六肽與HbA0衍生六肽分離的影響極大，對出峰時間也有影響。因此，需使用pH計，仔細認真調節pH。另：流動相最好不要保存，每次使用都現配現用。

作為一個檢測方法，精準性至關重要。本研究對低、中、高3個濃度全血樣本進行反復多次分析，最后得出總CV依次為1.61%、1.74%和0.90%，說明本方法精密度良好；對3個濃度水平的國家有證標準物質GBW09181- GBW09183進行測定，測定結果與認證值的偏差分別為：-0.09%，-0.04%，0.19%，對應的偏倚分別為-3.81%，0.96%，3.53%，結果偏倚在允許范圍內。本方法使用對氨基苯磺酸作為衍生試劑，精密度良好，如采用帶全自動衍生功能的自動進樣器進行在線衍生，衍生后直接進樣分析，可消除離線衍生進樣時間不同和手工操作產生的誤差，避免衍生產物衰減的可能性，保證進樣時間的一致，不僅可提高精密度，還可提高準確性。如為提高衍生效果，也可使用兩種衍生試劑。

本方法采用國際基準校準物質進行線性范圍的確定，國際基準校準物質給出的是國際單位：mmol/L，為方便臨床應用，根據目前國際HbA1c標準化規定，采用回歸方程NGSP-HbA1c=0.915(IFCC-HbA1c)+2.15%[16]進行了換算，相應的單位為：%。

HbA1c測定方法會受到不同干擾因素的影響，常見的主要為變異血紅蛋白和衍生血紅蛋白，為證明本方法的特異性，對此進行了實驗。由于本方法測定水解后的衍生六肽片段，常見的變異血紅蛋白對本方法不形成干擾，因此進行了衍生血紅蛋白的干擾實驗。如長期服用阿司匹林，可使血紅蛋白乙酰化；慢性腎病患者，可使血紅蛋白甲酰化，本研究對此進行了實驗。結果表明本方法不受衍生血紅蛋白干擾，同時也驗證了常規離子交換高效液相色譜法受衍生血紅蛋白干擾。

本研究還測定了20份人血樣本，以初步評價本方法與常規離子交換高效液相色譜法測定結果的偏差，結果表明本方法與常規離子交換高效液相色譜法有很好的相關性，進一步證明常規離子交換高效液相色譜法與本方法是兩種可靠的檢測方法。

本方法使用對氨基苯磺酸為衍生化試劑，通過HPLC進行分離、測定。測定準確度、穩定性及特異性結果表明，本方法設計合理，毋需質譜，可報告范圍滿足臨床需求，適用于HbA1c的定量分析。

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Determination of glycated hemoglobin by pre-column derivatization and HPLC separationWANGDong-huan,ZHOUWei-yan,ZHANGTian-jiao,etal.(NationalCenterforClinicalLaboratory,BeijingHospital,Beijing100730,China)

Abstract:ObjectiveA method for separation and quantification of glycated hemoglobin by pre-column derivatization and HPLC was developed.MethodsHaemoglobin is cleaved into peptides by the enzyme endoproteinase Glu C,the glycated and non-glycated N-terminal hexapeptides of the β chain (HbA1chexapeptides and HbA0hexapeptides)were obtained,separated and quantified of HbA1chexapeptides and HbA0hexapeptides by derivation with p-aminobenzenesulfonic acid and HPLC.The percentage of HbA1cin the sample can be calculated from the peak area ratios for the HbA1cderivative hexapeptides and HbA0derivative hexapeptides.ResultsThe investigation obtain the total coefficients of variation (CV) for sample analysls were 1.61%,1.74% and 0.90%.A standard curve regression equation Y=1005X+7.26，R=0.995 9,The linearity range was 0.3% -15.6% HbA1c.The results on certified reference materials showed bias of -3.81%-3.53%%.ConclusionA highly precise and accurate method for measuring HbA1chas been developed by pre-column derivatization and HPLC.

Key words:Hemoglobin A,glycosylated; peptide; pre-column derivatization; Chromatography,liquid

(收稿日期：2015-01-14)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R446.11

文章編號：1007-4287(2015)12-1991-05

*通訊作者

基金項目：國家自然科學基金(項目號：81171665，81201337，81301488)