遠程肢體缺血后適應對大鼠海馬區TLR4和IL-6表達水平的影響

張　江,周　濤,王大力,劉會英

(華北理工大學附屬醫院 神經內科二病區,河北 唐山063000)

遠程肢體缺血后適應對大鼠海馬區TLR4和IL-6表達水平的影響

張江,周濤,王大力,劉會英

(華北理工大學附屬醫院 神經內科二病區,河北 唐山063000)

摘要：目的觀察大鼠遠程缺血后適應時海馬CA1區TLR4、IL-6表達變化并探討其意義。方法72只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、對照組、遠程缺血后適應組，各組又分為12 h、24 h、48 h、72 h各時間點組，每組6只。應用改良Longa法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型并以此為對照組，在再灌注即刻用止血帶結扎/放松雙后肢根部各30 min循環3次，作為遠程缺血后適應處理方法。HE染色觀察大鼠海馬CA1區組織病理學變化，免疫組織化學染色觀察大鼠海馬CA1區TLR4和IL-6的表達。結果在大鼠海馬CA1區，遠程缺血后適應組神經元缺失、細胞腫脹較對照組明顯減輕。與假手術組相比，對照組與遠程缺血后適應組TLR4和IL-6表達明顯增高(P<0.05)；且遠程缺血后適應組TLR4和IL-6的表達較對照組明顯減少(P<0.05)。結論遠程缺血后適應具有腦保護作用，這種作用可能與抑制TLR4和IL-6表達有關。

關鍵詞：遠程缺血后適應；TLR4；IL-6；表達

(ChinJLabDiagn,2015,19:2001)

遠程缺血后適應[1]是指器官缺血后，對遠隔器官進行短暫的輕度的缺血再通，可起到保護作用。研究表明肢端缺血可以減少海馬CA1區的延遲神經元損傷[2]。但其機制尚不清楚。ILR4為人體固有免疫的觸發因子[3]，參與介導對抗病原體的一系列炎癥反應，誘導促炎性細胞因子IL-6等的釋放。鑒于上述過程是缺血再灌注損傷的重要機制之一[4]，本實驗在此基礎上，探討了遠程缺血后適應的腦保護作用與TLR4和IL-6表達的關系。

1材料與方法

1.1動物分組及模型制備72只健康雄性SD大鼠(自北京華阜康生物科技股份有限公司購買,實驗動物使用許可證編號：SCXK(京)2009-2004)，體重250 g-300 g，隨機分為假手術組(S組)、對照組(C組)、遠程缺血后適應組(P組)，各組分為12 h、48 h、24 h、72 h共4個時間點組，每組6只大鼠。應用改進的Longa[5]法，建立右側腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，小心分離右側頸總動脈和頸外動脈，線栓由頸總動脈進入頸內動脈至大腦中動脈，線栓頭端距血管分叉處約18 mm。2 h后再次麻醉大鼠，C組直接拔除線栓；P組在拔除線栓后即刻用止血帶扎緊雙側后肢根部，扎緊/松開各10 min循環3次，此為RIP。假手術組只分離出各動脈，不置入線栓。以大鼠麻醉清醒后出現對側肢體癱瘓為標準。參照Zea Longa[5]的5分制評分標準，剔除評分為0分和4分的大鼠，保證各小組6只不變。

1.2HE染色及免疫組化染色分別于各時間點將大鼠深度麻醉后，用4%多聚甲醛溶液行心臟灌流，斷頭取腦后行外固定。鼠腦做約2 mm冠狀切片，常規石蠟包埋，制成厚約4 μm的切片，取海馬最大的冠面切片用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.1HE染色依照常規方法脫蠟、染色、脫水、透明、封片后，光鏡下觀察。

1.2.2免疫組化染色TLR4和IL-6抗體均為兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(由北京博奧森生物有限公司)，稀釋度均為1∶200；PV6001試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術有限公司。應用常規PV法：脫蠟至去離子水，枸櫞酸修復緩沖液行抗原高壓熱修復，自然冷卻至室溫，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS緩沖液洗滌3 min×3次，滴加特異性抗體，4℃孵育過夜，PBS緩沖液洗滌3 min×3次，PV6001試劑盒中的試劑(抗兔抗體酶復合物)37℃孵育30 min，再次PBS緩沖液洗滌3 min×3次，DAB鏡檢控制顯色，流水沖洗3 h以上去除DAB殘留物，蘇木素復染，脫水、透明封片。光鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照，以胞漿為棕黃色為陽性。每只大鼠取連續4張相同部位的切片，每張切片在200倍光鏡下隨機取海馬CA1區的6個不同視野，通過Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統統計每個視野的免疫組化陽性細胞數，取其平均數為該大鼠陽性細胞的表達數量。

2結果

2.1各組大鼠海馬CA1區HE染色結果S組大鼠海馬結構清晰，CA1區細胞形態正常，排列整齊，胞質染色均勻，胞核淺藍色，圓形或橢圓型，核仁明顯，核膜清晰(圖1)。C組大鼠海馬結構松散，CA1區細胞稀疏，神經元明顯減少，可見較多的神經元胞體縮小，胞漿濃縮深染，胞核固縮，核仁核膜消失；也有的神經元腫脹淡染，呈三角形或者梭形；有的胞漿出現大片空泡區，提示腦水腫嚴重；有些區域出現小片壞死，細胞核碎裂甚至溶解消失(圖2)。P組大鼠海馬結構欠完整，但較C組神經元缺失減少，胞體縮小深染現象明顯改善，神經元腫脹減輕(圖3)。

圖1假手術組圖2對照組圖3遠程缺血后適應組

2.2各組大鼠海馬CA1區免疫組化染色結果陽性結果判定：海馬CA1區的TLR4及IL-6陽性細胞表達為胞漿呈棕黃色，胞核呈淺藍色或紫藍色。

2.2.1TLR4染色結果在海馬CA1區，S組各時間點TLR4表達水平均低。C組與P組TLR4表達較S組明顯增高(P<0.05)。在C組，TLR4表達12h開始表達，24h達到高峰，72h開始下降。P組TLR4陽性表達在72h前均低于C組(P<0.05)，而72h時略高于C組，但無統計學意義(P>0.05)。實驗結果提示缺血再灌注時，大鼠海馬CA1區TLR4被激活，但遠程缺血后適應使TLR4的激活受到抑制而延遲。(表1)

表1　各組大鼠海馬CA1區TLR4陽性細胞表達數比較±s)

注：各觀察時間點n=6；*與假手術組比較P<0.05；△與對照組比較P<0.05。

2.2.2IL-6染色結果陽性結果判定同上述，在海馬CA1區，S組各時間點IL-6僅有少量表達。C組與P組有明顯的IL-6表達，與S組相比均有統計學意義(P<0.05)。IL-6在C組12 h開始表達，48 h達到高峰，72 h開始下降。P組IL-6陽性細胞表達在各時間點均低于C組，有顯著統計學意義(P<0.05)。實驗結果提示缺血再灌注時，大鼠海馬CA1區的IL-6被激活，但遠程缺血后適應使IL-6的激活受到抑制。(表2)

表2　各組大鼠海馬CA1區IL-6陽性細胞表達數比較±s)

注：各觀察時間點n=6；*與假手術組比較P<0.05；△與對照組比較P<0.05。

3討論

缺血再灌注所致的腦損傷，已被證明是影響關于血管再生預后的重要因素[6]，許多研究者都致力于尋找新的藥物和方法來保護腦組織免受缺血再灌注損傷。早在50多年前，Sewell[7]及其同事就曾報告,間歇的再灌注(相當于目前的缺血后處理),可以廢除心室顫動。直到2003年Z.Q Zhao[8]等人提出“缺血后適應”這一假說后，缺血后適應的概念引起越來越多的重視。而如今，經典的缺血后適應已經延伸包括藥理學后適應和遠程缺血后適應。最早發現可以實施遠程缺血后適應的器官為腎臟，由Kerendi等[2]通過短暫夾閉小鼠腎動脈而實現對小鼠缺血心肌的保護作用。接著肢體遠程缺血后適應的心肌保護作用也得到證實[9]。在腦缺血的研究中，也已有研究提示肢體的缺血后適應在具有神經保護作用[10]。

對于遠程缺血后適應的機制少有報道，目前普遍認為遠程缺血后適應的腦保護作用在于通過肢端、腎臟等短暫的缺血再灌注使心臟或腦產生對隨后而來的較嚴重缺血再灌注損傷的耐受能力，而缺血再灌注損傷的重要機制之一為免疫炎癥反應，TLR4則是免疫炎癥反應的重要環節，內源性配體與TLR4結合后發生結構改變，并募集髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88,MyD88)等轉接蛋白，通過MyD88依賴或非依賴性信號轉導通路激活轉錄因子NF-κB和干擾素相關蛋白(interferon binding protein，IRFs),進而誘導產生TNF-α,IL-1β和IFN-β等一系列炎癥細胞因子[11]。已有實驗證明，在樹鼩血栓性腦缺血的模型[12]中,缺血后適應4 h及24 hTLR4蛋白表達減少，提示缺血后適應可能與調控TLR4表達有關。

本研究實驗結果顯示，大鼠腦缺血再灌注后12 h時TLR4和IL-6的表達已經開始開始增高，提示缺血再灌注損傷炎癥反應在12 h已經啟動，TLR4和IL-6表達分別于24 h、48 h達到高峰，與對照組相比，遠程缺血后適應組TLR4表達在12 h、24 h、48 h均受抑制，提示遠程缺血后適應的腦保護作用與抑制TLR4表達有關，而在72 h表達水平與對照組相當，可能與腦缺血后期腦組織的自身修復有關。IL-6在遠程缺血后適應中的表達于各時間點都低于對照組，提示其激活在遠程缺血后適應中受到抑制。

通過本實驗可以推斷遠程缺血后適應可以通過抑制TLR4、IL-6相關的炎癥反應實現腦保護作用，為進一步明確遠程缺血后適應的分子機制以及臨床應用提供了依據。

參考文獻：

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[3]A.F.Mc Gettrick and L.A.J.O’Neill.Toll-like receptors:key activators of leucocytes and regulator of haematopoiesis[J].British Journal of Haematology,2007,139:185.

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[7]Sewell WH,Koth DR,Huggins CE.Ventricular fibrillation in dogs after sudden return of flow to the coronary artery[J]．Surgery,1955,38(6):1050.

[8]McClanahan T,Nao B,Wolke L,et al.Brief renal occlusion and reperfusion reduces myocardial infarct size in rabbits[J]．FASEB J,1993:7.

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[10]盧旭霞,牛小媛,羅玉敏,等.遠程缺血后適應對大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響[J].中國腦血管病雜志,2013,7[3]:139.

[11]N Zou,L Ao,Cleveland Jr,et al.Critical role of extracellular heat shock cognate protein 70 in the myocardial inflammatory response and cardiac dysfunction after global ischemia reperfusion[J].American Journal of Physiology,2008,294:2805.

[12]馮蕊，李樹清.缺血后適應對腦缺血樹鼩海馬TLR4表達的影響[J]．中國病理生理雜志,2011,27:1048.

The effect on the expression of TLR4 and IL-6 in the hippocampus of rats after the remote limb isehemic postconditioningZHANGJiang，ZHOUTao,WANGDa-li,etal.(NO.2DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of TLR4 and IL-6 expression in rats hippocampus CA1 region in remote ischemic postconditioning(RIP) and explore its significance.MethodsAll the 72 male SD rats were divided into Sham group,Contrast group and RIP group randomly.Each group was divided into 4 time points:12 h,24 h,48 h and 72 h group.There were 6 rats in each group.Use the cerebral ischemia-reperfusion model which was established with modified longa method as the contrast group.The method of RIP was to Fasten rats Posterior limbs by a tourniquet for 30 min immediately,then relax them for 30 min， repeat 3 times.To observe the pathological variation of hippocampus CA1 region by HE dyeing；to test the expression of TLR4 and IL-6 by immunohistochemical staining.ResultsCompared to contrast group,neuronal loss and swelling reduced significantly in RIP group.Compared to sham group,the TLR4 and IL-6 expression in contrast group and RIP group increased significantly(P<0.05).Compared to contrast group,the TLR4 and IL-6 expression in RIP group reduced significantly(P<0.05).ConclusionRIP dose have protective effect on cerebral ischemia.The effect may be associated with the inhibition of TLR4 and IL-6 expression.

Key words:Remote ischemic postconditioning；TLR4；IL-6；expression

(收稿日期：2015-01-20)

作者簡介：張江(1971-)，男，碩士研究生，主任醫師，教授，碩士研究生導師，副主任，研究方向：腦血管疾病。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R743.3

文章編號：1007-4287(2015)12-2001-04