肝螺桿菌誘導不同品系小鼠慢性肝損傷與Th1/Th2細胞功能變化的分析

李紅艷,王　靜,盛傳倫,趙曉南

(吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033)

肝螺桿菌誘導不同品系小鼠慢性肝損傷與Th1/Th2細胞功能變化的分析

李紅艷,王靜,盛傳倫,趙曉南*

(吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033)

摘要：目的觀察不同品系小鼠感染H.hepaticu后的肝臟病理損傷與Th1/Th2細胞功能的變化的關系。方法SPF級雄性BABL/c Cr、SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠接種 H.hepaticus標準菌株ATCC51450菌液0.2 ml(1×108CUF/ml)，連續3次，每次間隔48 h，對照組灌飼等量的PBS。于末次接種H.hepaticus后第16周處死小鼠，留取血清和肝臟，一份肝組織行病理組織學檢查，另一份肝組織及血清應用ELISA方法檢測細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5含量。結果H.hepaticus感染后16周時BALB/c Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.001)；BALB/c Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠(P<0.001)；而SCID/ Cr小鼠、C57BL/6 Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；H.hepaticus感染后的各品系小鼠血清、肝臟組織中IL-4及IL-5含量與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；H.hepaticus感染后BALB/c Cr小鼠血清及肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量隨著肝臟病理評分的增高而增加(P<0.05；P<0.01)。結論H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠后誘導慢性肝損傷的程度與Th1細胞因子IFN-γ、TNF-α的水平呈正相關；具有免疫活性小鼠H.hepaticus感染后宿主免疫反應是以Th1細胞為主的免疫反應。

關鍵詞：肝螺桿菌；不同品系小鼠；慢性肝損傷；Th1/Th2細胞功能

(ChinJLabDiagn,2015,19:2004)

1992年，美國國立癌癥研究所從發生了較高水平肝癌的雌性A/JCr小鼠的膽小管和膽囊中檢出一種螺旋狀細菌，命名為肝螺桿菌 (Helicobactel hepaticus,H.hepaticus)[1]。H.hepaticus不僅定植于多種敏感品系小鼠的下位腸道及肝膽系統，引起腸道炎癥性病變及慢性活動性肝炎，尤其是雄性的A/JCr小鼠，甚至導致肝細胞腺癌和腫瘤[2,3]。感染H.hepaticu的A/JCr小鼠肝臟血管周圍、肝實質以及膽囊周圍出現多個單核細胞浸潤病灶，這些損傷提示在肝膽管系統可能存在針對H.hepaticus抗原細胞介導的免疫反應[2]。研究發現H.hepaticus感染A/JCr小鼠的宿主反應與人類感染H.pylori相類似，兩者所引起的病理改變均與細菌的持續定植以及顯著的免疫反應所導致的炎癥損傷相關[2,4]。細胞介導的免疫反應在螺桿菌的持續定植或促進損傷方面的作用機制目前還沒有確定。H.pylori、H.felis的免疫反應均為Th1樣反應，因為免疫細胞產生IFN-γ多于IL-4[5-7]。Th細胞是能輔助T、B淋巴細胞應答的功能亞群。生理狀態下，體內Th1和Th2細胞可分別產生Th1型和Th2型細胞因子，并相互調節、相互制約，它們的失調與感染性疾病以及自身免疫性疾病相關。因此本研究針對H.hepaticu感染誘導出慢性肝損傷的不同品系小鼠，檢測其血清及肝臟組織中與Th1細胞功能相關的細胞因子IFN-γ、TNF-α含量以及與Th2細胞功能相關的細胞因子IL-4、IL-5 的含量，觀察不同品系小鼠感染H.hepaticu后的Th1/Th2細胞功能的變化及其與肝臟病理損傷的關系，為進一步探討H.hepaticu致病機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1H.hepaticus標準菌株來源及培養

H.hepaticus標準菌株ATCC51450購自美國國家標準菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)公司。凍存菌株經布氏瓊脂培養基復蘇，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高濕度條件下培養7~10天，可疑菌落經鑒定為H.hepaticus后進行純培養2-3代，備用。

1.1.2實驗動物及飼養

4-6周齡無特定病原菌(SPF)級雄性BABL/C、C57BL/6小鼠，購自吉林省高新醫學實驗動物中心，SCID小鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司。體重16-28克，分籠飼養，飼喂消毒的食物(食物根據小鼠體重限量供給)及水。

1.2實驗分組與方法

1.2.1小鼠H.hepaticus感染模型的建立

已經證實無H.hepaticus感染的SPF級雄性BABL/cCr、SCID/Cr、C57BL/6Cr小鼠各10只，按照文獻介紹方法接種H.hepaticus[2]。具體步驟如下：禁食12 h后接種制備好的H.hepaticus標準菌株ATCC51450菌液0.2毫升(1×108CUF/ml)，對照組灌飼等量的PBS，連續3次，每次間隔48 h。

于最后一次接種H.hepaticus后第16周時，禁食12 h后處死小鼠，采用眼球摘除法取血0.3-0.5 ml，分離血清并于-80℃保存，統一行ELISA法檢測血清抗H.hepaticus-IgG抗體水平及細胞因子水平；隨機留取16周各組小鼠的肝臟、盲腸，用無菌生理鹽水沖洗腸內容物，將組織加入適量生理鹽水搗碎，1000×g離心10 min，取上清液-80℃保存統一行細胞因子水平檢測。

1.2.2血清抗H.hepaticus-IgG抗體檢測

應用H.hepaticus標準菌株制備抗原包被ELISA反應板，應用ELISA法行小鼠血清中抗H.hepaticus抗體檢測。

①H.hepaticus超聲粉碎抗原的制備

選取穩定傳代的H.hepaticus標準菌株ATCC51450在固體培養基培養7-10天，用無菌生理鹽水洗脫固體平板上的細菌，4℃、3 000 rmp離心10 min后棄上清，重新加入生理鹽水并用毛細細管吹打，懸浮后再離心，收集細菌。然后用小體積無菌生理鹽水懸浮，冰浴超聲粉碎10 min，4℃、12 000 rmp 離心20 min，收集上清。細菌殘渣再超聲粉碎10 min，重復上述過程一次。合并兩次上清，測蛋白濃度，分裝后置-80℃保存，備用。

抗原濃度計算：超聲粉碎細菌抗原稀釋后，用U-341紫外可見分光光度計測260 nm和280 nm波長的吸光度值(A260、A280)，按下列公式計算濃度：

蛋白濃度(mg/ml)=(1.74×A280-0.75×A260)×稀釋倍數

②病理組織學分析

取小鼠肝臟組織以10%甲醛固定，石蠟切片，行HE染色供組織學診斷。病理組織學由兩人作雙盲檢查，采用Mohammadi 等[8]提出的評分標準，采用半定量計分方法：肝臟組織學損傷按炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死、靜脈周圍卵圓細胞和膽小管增生、Ito細胞和增生枯否細胞以及多型性肝細胞這5種形態學變量分級：0分(正常)，1分(微小病變；病變累及≤5%)，2分(輕度：病變累及5-25%)，3分(中度：病變累及25-50%)和4分(重度：病變累及50%以上)。

③血清及組織中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5檢測：ELISA檢測試劑盒購自上海銳聰生物技術有限公司，具體操作方法參照說明書。

④統計學方法

2結果

2.1不同品系小鼠H.hepaticus感染后16周時Th1細胞功能分析

為了分析不同品系小鼠H.hepaticus感染后與Th1細胞功能的關系，對H.hepaticus感染后16周時不同品系小鼠血清及肝臟組織中的IFN-γ、TNF-α含量進行檢測。結果顯示H.hepaticus感染后16周時BALB/cCr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.001)；BALB/cCr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于SCID/Cr、C57BL/6Cr小鼠(P<0.001)；而SCID/Cr小鼠、C57BL/6Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　不同品系小鼠H.hepaticus感染后血清及肝組織中IFN-γ、TNF-α含量的比較

注：BALB/c Cr小鼠與對照組相比P<0.001；實驗組BALB/c Cr小鼠血清及組織IFN-γ、TNF-α含量與C57BL/6 Cr及SCID/ Cr小鼠相比P<0.001

2.2不同品系小鼠H.hepaticus感染后16周時Th2細胞功能分析

H.hepaticus感染后的各品系小鼠血清、肝臟組織中IL-4及IL-5含量與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；各品系小鼠之間相比，也無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2　不同品系小鼠H.hepaticus感染后血清及肝組織中IL-4、IL-5含量的比較

各組之間比較P>0.05

2.3不同品系小鼠H.hepaticus感染肝臟病理評分與Th1細胞功能變化的關系

BALB/c Cr小鼠感染H.hepaticus后肝臟及血清中的IFN-γ、TNF-α含量明顯增高，為了進一步探討H.hepaticus感染所誘導的慢性肝損傷與Th1細胞功能變化的關系，我們按照不同的肝臟病理損傷評分來觀察Th1細胞功能的變化。結果顯示H.hepaticus感染后BALB/c Cr小鼠血清及肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量隨著肝臟病理評分的增高而增加(P<0.05；P<0.01)。見圖1。

圖1　H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠血清及肝組織中IFN-γ、TNF-α含量與肝臟病理評分的關系

3討論

螺桿菌屬是一組革蘭氏陰性的微需氧螺旋狀細菌，研究顯示該菌屬與人或動物的一些疾病的發生具有一定的相關性，如胃腸道、肝膽疾病以及某些腫瘤等[9]。H.hepaticus最初是在A/JCr小鼠體內發現的，可引起多種敏感品系小鼠發生慢性活動性肝炎，甚至肝細胞癌，而在免疫缺陷小鼠可導致炎癥性腸病[10]。本課題組應用不同品系小鼠C57BL/6Cr、BALB/cCr以及SCID/Cr小鼠接種H.hepaticus，其中C57BL/6Cr、BALB/cCr小鼠具有免疫活性，而SCID/Cr小鼠為免疫缺陷小鼠，BALB/cCr及SCID/Cr小鼠感染H.hepaticus后均出現明顯的盲腸結腸炎癥及慢性活動性肝炎，而同樣具有免疫活性的C57BL/6Cr小鼠肝臟及腸道炎癥均較輕，因此探討H.hepaticus感染后宿主的免疫應答反應顯得十分重要。

本研究結果顯示BALB/c Cr小鼠感染H.hepaticus后血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯升高；SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠感染H.hepaticus后血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量雖較對照組有所增高，但兩者之間無顯著性差異，表明SCID/ Cr小鼠缺乏具有免疫活性小鼠感染H.hepaticus后所表現的重要的T細胞介導的免疫應答；而C57BL/6 Cr小鼠提示其感染H.hepaticus后病理損傷輕可能與其Th1細胞反應不明顯有關。干擾素的過量產生以及低水平的IL-4、IL- 5與H.felis相關性胃炎小鼠模型是一致的[11]。自然殺傷細胞和Th1細胞均可產生IFN-γ，IFN-γ是一種炎癥因子，促進IL-12的產生，進一步促進幼稚T細胞向Th1細胞表型轉換[12,13]。Th1介導的應答中，IFN-γ釋放后誘導內皮細胞產生趨化性細胞因子IP-10、Mig和MCP-1。IP-10、Mig作用于Th1細胞表面的趨化因子受體CXCR3，MCP-1可吸引單核吞噬細胞，從而使這些細胞聚集到炎癥部位，增強Th1型反應。本研究中H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠后誘導慢性肝損傷的程度與Th1細胞因子IFN-γ、TNF-α的水平呈正相關，而以Th1為主的免疫反應常和炎癥反應及組織損傷有關，因此推測H.hepaticus感染的慢性肝損害的發生，伴隨著Th1細胞介導的免疫應答反應的產生，該反應加劇了感染的過程。

總之，本研究結果顯示H.hepaticus感染后引起明顯病理損傷的BALB/c Cr小鼠表現為Th1細胞介導的免疫反應，我們可以推測H.hepaticus感染引起病理損傷的結果至少部分原因來自宿主的免疫反應及相關炎癥，Th1細胞介導的炎性反應對宿主來講可能是有害的。因此，將免疫策略轉向Th2細胞介導的免疫反應，這也許能為抑制細菌定植或減緩疾病惡化提供更多的保護。此外本實驗也顯示SCID/ Cr小鼠感染H.hepaticus后可出現與BALB/c Cr小鼠相似的病理損傷，但其缺乏有效的宿主免疫應答，這表明H.hepaticus感染小鼠導致病理損傷的發病機制不能完全歸因于宿主的免疫反應，其致病機制是一個多因素相互作用的結果，還有待于進一步研究探討。

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《中國實驗診斷學》雜志社聲明

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Analysis of chronic liver injury induced by Helicobacter hepaticus in mice of different strains and functional changes of Th1/Th2 cellsLIHong-yan,WANGJing，SHENGChuan-lun，etal.(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversty130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the relationship between liver pathological injury induced by H.hepaticus in mice of different strains and Th1/Th2 cell function.MethodsSPF-class male BABL/c Cr、SCID/Cr,C57BL/ 6 Cr mice inoculated H.hepaticus standard strain ATCC51450 0.2ml bacterial suspension (1×108CUF/ml)，for 3 times,each time interval of 48 hours，the control Group gavage the same amount of PBS.At last after Helicobacter hepaticus inoculation 16 weeks mice were killed，specimens from serum and liver，one liver tissue for histopathology；application of ELISA method to detect cytokines IFN-γ,TNF-α,IL-4,IL-5 contents of another liver tissue and serum.ResultsAfter H.hepaticus infection 16 weeks，IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in BALB /c Cr mice were significantly higher than the control group(P<0.001)；which IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in BALB /c Cr mice were significantly higher than SCID/ Cr mice and C57BL/6 Cr mice (P<0.001)；Compared with the control group，the IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in SCID/ Cr mice and C57BL/6 Cr mice after H.hepaticus infection were no significant difference (P>0.05)；Compared with the control group，the IL-4,IL-5 contents of serum and liver tissue in all strains of mice after H.hepaticus infection were no significant difference (P>0.05)；IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in H.hepaticus infected BALB/c Cr mice were increased with liver pathology scores increased (P<0.05；P<0.01).ConclusionThe degree of chronic liver injury induced by H.hepaticus infection in BALB/c Cr mice were positively correlated with IFN-γ,TNF-α levels of Th1 cytokines；Host immune response after immunocompetent mice infect H.hepaticus is a Th1-based immune response.

Key words:Helicobacter hepaticus; different strains of mice; chronic liver damage；Th1/Th2 cell function

(收稿日期：2015-01-19)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R392

文章編號：1007-4287(2015)12-2004-05

*通訊作者