實(shí)時(shí)定量PCR檢測KIR轉(zhuǎn)錄水平的方法構(gòu)建

陳　鷗，陳會(huì)會(huì)，姜擁軍，尚　紅*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科 艾滋病研究所，遼寧 沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測KIR轉(zhuǎn)錄水平的方法構(gòu)建

陳鷗1，2，陳會(huì)會(huì)1，姜擁軍1，尚紅1*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科 艾滋病研究所，遼寧 沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

摘要：目的構(gòu)建可定量檢測殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)轉(zhuǎn)錄水平的方法。方法篩選KIR3DS1和KIR3DL1保守區(qū)特異性引物，利用RT-PCR和熔解曲線法對引物特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，建立可定量的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，應(yīng)用SYBR Green RT-PCR方法檢測標(biāo)本中KIR3DS1和KIR3DL1的mRNA含量。結(jié)果通過電泳和實(shí)時(shí)定量PCR的熔解曲線明確了KIR3DS1和KIR3DL1引物，其特異性好，無雜帶。應(yīng)用TA克隆建立的KIR定量標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系好，可檢測待測物的范圍大。應(yīng)用臨床標(biāo)本可檢測出兩組標(biāo)本有顯著差異，符合臨床預(yù)期。結(jié)論本文建立的KIR mRNA定量檢測方法，可以定量檢測活化和抑制性KIR,可以進(jìn)一步研究不同疾病進(jìn)展的機(jī)制以及預(yù)測疾病的臨床轉(zhuǎn)歸。

關(guān)鍵詞：KIR基因；KIR3DS1；KIR3DL1；實(shí)時(shí)定量PCR

(ChinJLabDiagn,2015,19:2030)

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)是一組主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面的分子，屬于免疫球蛋白受體家族，在淋巴細(xì)胞識(shí)別“自己”與“非己”及殺傷功能的調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用，其配體為人類白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)Ⅰ類分子。KIR有2種類型，即活化性KIR和抑制性KIR，與細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子相互作用，抑制或者活化細(xì)胞毒活性，調(diào)控免疫應(yīng)答過程[1]。

KIR等位基因數(shù)目和類型會(huì)直接影響病毒感染、多種自身免疫性疾病的發(fā)生和骨髓、器官移植以及造血干細(xì)胞移植的存活[2,3]。

與KIR基因的數(shù)目和類別相比較，KIR轉(zhuǎn)錄水平更能貼切地反映與疾病進(jìn)展的關(guān)系。Pavel Bostik等,報(bào)道高水平的SIV的復(fù)制與增長的KIR3DL mRNA表達(dá)水平密切相關(guān)[6]； Galit Alter et al報(bào)道，在急性HIV感染時(shí)，活化性KIR的mRNA水平增高；在慢性HIV感染時(shí)，抑制性KIR的mRNA增高[7]。但目前國人KIR mRNA水平的定量檢測還少有報(bào)道，其檢測方法建立，對研究國人KIR的表達(dá)水平與各種疾病進(jìn)程的關(guān)系，為尋找有效的防治方法提供的技術(shù)保障。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑外周血單個(gè)核細(xì)胞來自艾滋病患者和正常體檢人群，總RNA提取試劑用QIANGEN RNA試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒用ImProm-ⅡTMReverse Transcription System (Promega)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)。

1.2方法

1.2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞和RNA的提取取EDTA抗凝外周血5 ml，常規(guī)Ficoll密度梯度法離心獲PBMC。用QIAGEN試劑盒提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)和 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定濃度和純度后-80 ℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按PROMEGE 公司的Improm-ⅡTM Reverse Transcriptim System 說明書進(jìn)行操作。取已經(jīng)提取好的RNA 1 μg(4.5 μl)加入Oligo dt 0.5 μg(0.5 μl),70℃ 5 min，冰浴>5 min。配置逆轉(zhuǎn)錄體系，去離子水7 μl,buffer 4 μl,Mgcl21 μl,dNTP 1 μl,RNA抑制酶0.5 μl,逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl。反應(yīng)條件：25℃ 5 min,42℃ 60 min,70℃ 15 min,4℃。 將獲得的cDNA于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物的設(shè)計(jì)從GenBank上下載KIR3DS1和KIR3DL1的核苷酸序列，使用PRIMER 5.0軟件在引物的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。引物序列為：KIR3DS1 F:5’-CAGCGCTGTGGTGCCTCGC-3’,KIR3DS1R:5’-CTGTGACCATGATCACCAT-3’ KIR3DL1F:5’-GGACATCGTGGTCACAGGTCC-3’ KIR3DL1R:5-CACTGAGGTCCCAATCAGAATG-3；GAPDH：F:5’-ACCGGGAAGGAAATGAATGG-3’ R:5’-GCAGGAGCGCAGGGTTAGT-3’

1.2.4KIR定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備將-80℃凍存的cDNA經(jīng)過普通PCR擴(kuò)增后，切膠純化，選用TAKARA公司的PMD18T載體進(jìn)行TA克隆。過夜連接后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。取感受態(tài)細(xì)胞100 μl置于冰上融化，取5 μl連接后產(chǎn)物冰上加入100 μl感受態(tài)細(xì)胞，冰上30 min，42℃ 90 s，從ep管中轉(zhuǎn)移感受態(tài)到有400 μl SOC培養(yǎng)基的管中，將100 μl產(chǎn)物涂于LB培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。之后用干凈的槍尖挑取單個(gè)菌落后搖菌。質(zhì)粒小提后進(jìn)行鑒定。測序鑒定產(chǎn)物的正確性。并用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒的濃度，OD260/OD280在1.7-1.9之間。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備選用TAKARA公司的SYBR GREEN 試劑盒進(jìn)行檢測。將質(zhì)粒KIR3DS1,KIR3DL1,GAPDH按5個(gè)濃度梯度1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000進(jìn)行稀釋后進(jìn)行檢測。檢測反應(yīng)體系為:Real Master Mix加入25 μl，DEPC水18 μl，Rox reference dye 1 μl,上下游引物分別為1 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s,1個(gè)循環(huán)，95℃ 30 s,60℃ 34 s 40個(gè)循環(huán)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS軟件17.0進(jìn)行分析。分析健康對照者，病毒感染者各基因表達(dá)水平的不同，并計(jì)算P值。

太陽能制冷系統(tǒng)分為集熱系統(tǒng)和制冷系統(tǒng)兩部分。集熱系統(tǒng)是對太陽能進(jìn)行收集，并且將收集的太陽能用來驅(qū)動(dòng)吸收式制冷。集熱系統(tǒng)圖如圖1，制冷系統(tǒng)圖如圖2所示。

2結(jié)果

2.1KIR定量標(biāo)準(zhǔn)品特異性分析用含有GAPDH,KIR3DS1,KIR3DL1的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增并以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如下圖(見圖1)。當(dāng)退火溫度為56℃時(shí)，尚有很淺的非特異性條帶。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將退火溫度由56℃提升至60℃時(shí)，引物的特異性很好。從圖中可見，條帶清晰，片段長度正確。從RT-PCR角度說明引物的特異性高。測序結(jié)果與GENEBANK序列符合(G代表GAPDH,S代表KIR3DS1，L代表KIR3DL1)。

圖1　含GAPDH,KIR3DS1,KIR3DL1質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2目的基因和管家基因熔解曲線從圖中可見，熔解曲線出現(xiàn)單獨(dú)特異性峰，也從實(shí)時(shí)定量PCR的角度說明引物特異性高(見圖2)。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線分別將目的基因和管家基因進(jìn)行1∶103，1∶104，1∶105，1∶106，1∶107進(jìn)行倍比稀釋后，用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測，軟件將不同稀釋倍數(shù)稀釋點(diǎn)得到的不同CT值繪制成一條直線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系很好(見圖3)。

圖2AKIR3DL1的溶解曲線圖2BKIR3DS1的溶解曲線圖2CGAPDH的溶解曲線

圖2目的基因和管家基因熔解曲線

圖3　管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4KIR3DL1 mRNA實(shí)時(shí)定量檢測選取正常對照和病毒感染者兩組，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA，定量檢測KIR3DL1 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)病毒感染組KIR3DL1 mRNA水平顯著高于正常對照，P=0.0338(見圖4)。

圖4　KIR3DL1 mRNA在感染者和正常人的檢測

2.5KIR3DS1 mRNA實(shí)時(shí)定量檢測選取疾病處于不同階段的A、B兩組，比較KIR3DS1 mRNA定量水平，發(fā)現(xiàn)存在差異(P=0.0101)(見圖5)。說明上述檢測方法，可以針對病毒感染或疾病進(jìn)展的不同階段進(jìn)行加以區(qū)分。

圖5　KIR3DS1 mRNA在疾病不同階段的檢測

3討論

目前對于KIR mRNA的研究，報(bào)道較少。有國外文獻(xiàn)報(bào)道，KIR轉(zhuǎn)錄物水平在慢性HIV感染者中明顯高于急性感染者和正常對照組。這可能是由于HIV病毒的復(fù)制對KIR的激活所致。其中抑制性的KIR在慢性HIV-1感染者中含量是非常高的，在急性感染者中活化的KIR顯著高于正常對照組[8]。Ravet等研究了暴露未感染者(EU)和靜脈吸毒途徑的HIV感染者和正常對照者KIR等位基因的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)KIR2DL3的轉(zhuǎn)錄物水平在EU和對照組中低于HIV陽性組，而聯(lián)合KIR2DS2-/2DL2-/2DL3+在EU組中明顯高于HIV感染組，并且KIR3DL1水平在EU組中明顯低于IDU組[9]。

活化性KIR轉(zhuǎn)錄水平的增加會(huì)促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致IFN-γ和顆粒酶等細(xì)胞因子釋放增加，從而延緩疾病進(jìn)程。而抑制性KIR轉(zhuǎn)錄水平的增加會(huì)抑制淋巴細(xì)胞的功能，使病毒感染性疾病不斷進(jìn)展。因此檢測不同KIR轉(zhuǎn)錄水平，可以預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸。

本文建立的KIR mRNA定量檢測方法，選取了最佳引物序列和退火溫度，從而提高了引物的特異性，電泳結(jié)果顯示引物條帶清晰。從熔解曲線上看，引物出現(xiàn)單獨(dú)特異性峰，再一次證明了引物的特異性高。首次通過TA克隆建立的KIR定量標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋不同濃度，線性關(guān)系好，故可檢測范圍廣，標(biāo)本水平差異大也可適用。國外文獻(xiàn)中對KIR 的檢測多采用探針方法，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的KIR定量檢測方法特異性好，故采用SYBR Green 方法又降低了實(shí)驗(yàn)成本。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了定量檢測活化和抑制性KIR的實(shí)驗(yàn)方法,為進(jìn)一步研究不同疾病進(jìn)展的機(jī)制以及預(yù)測疾病的臨床轉(zhuǎn)歸提供了新思路。

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Method construction of quantitative real-time PCR for detecting KIR mRNA levelsCHENOu1,2,CHENHui-hui1,JIANGYong-jun1,etal.(1.LaboratouyofAIDSResearch,DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,FourthAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110032,China)

Abstract:To build quantitative real-time PCR for detecting (Killer cell Ig-like receptors，KIR) mRNA levels with SYBR Green method,we screened primers of KIR3DS1 and KIR3DL1 that aimed at the specific conservative region.Our experiment used PCR,electrophoresis and melting curve to find out the specificity of the primers and set up quantitative standard reference.Then we applied TA clone to build KIR quantitative standard reference which had a good linear relationship and a large detection range.Patients’ samples were tested with statistical differences between two groups and the results were in accordance with clinical expectation.In conclsion:the method we built can quantitatively detect both active and inhibitive mRNA levels of KIR and can people further understand the progress and clinical outcome of diseases.

Key words:KIR;real-time PCR;KIR3DS1;KIRSDL1

(收稿日期：2015-02-18)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R512.91

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-2030-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)課題資助(2008ZX10001-001)