淋巴細胞免疫分型對間質性肺病變的臨床分析

劉培培，姜悅垚，侯松萍*

(1．吉林大學中日聯誼醫院 呼吸內科，吉林 長春130033；2．吉林大學藥學院，吉林 長春130021)

淋巴細胞免疫分型對間質性肺病變的臨床分析

劉培培1，姜悅垚2，侯松萍1*

(1．吉林大學中日聯誼醫院 呼吸內科，吉林 長春130033；2．吉林大學藥學院，吉林 長春130021)

摘要：目的探討外周血淋巴細胞免疫分型及NK細胞水平變化對于間質性肺病變的原因是結締組織疾病所致，還是其它原因所致的臨床價值。方法50例間質性肺病變患者，分結締組織疾病組、非結締組織疾病組，每組25例；正常對照組25例，采用流式細胞術檢測外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+NK細胞、CD19+B淋巴細胞表達水平，比較三組間的外周血淋巴細胞各亞群的差異。結果結締組織疾病組與非結締組織疾病組相比，CD8+T細胞明顯增高(P<0.01);結締組織疾病組與正常對照組相比，CD8+T細胞也明顯增高,但CD56+數明顯降低,均P<0.05;非結締組織疾病組與正常對照組相比，外周血T 細胞各亞群均無明顯差異。結論結締組織疾病組外周血CD8+T細胞明顯增高、NK細胞數明顯降低；非結締組織疾病組外周血T 細胞各亞群未見明顯異常，提示外周血淋巴細胞免疫分型有助于識別免疫性損傷引起的結締組織疾病并發間質性肺病變。

關鍵詞：結締組織疾病；非結締組織疾病；間質性肺病；淋巴細胞亞群；NK細胞

(ChinJLabDiagn,2015,19:2066)

彌漫性間質肺疾病(DILD)是一組臨床特征相似，免疫病理過程各異的眾多肺疾病組成的疾病譜，病因不明者占65%，其發病機制至今尚未完全清楚[1]。病毒、細菌、真菌、吸入有害氣體、藥物、風濕病等均可導致間質性肺病。ILD涵蓋許多疾病,各有其臨床特點,診斷有其難處,治療和預后又因診斷而異[2]。本文通過檢測結締組織疾病患者、非結締組織疾病患者和正常人的外周血淋巴細胞免疫分型，探討其對于間質性肺病變的原因是免疫損傷，還是非免疫損傷所致提供理論依據。

1材料與方法

1.1臨床資料選取吉林大學中日聯誼醫院于2012年5月至2014年5月期間收治的50間質性肺病變患者。其中25例結締組織疾病并發間質性肺病變患者，診斷按2012年風濕病新版全套指南標準[3]，年齡24-80歲，平均 54.2±16.8 歲,其中男11例，女14例，結締組織疾病組病種構成為：類風濕關節炎7例，多發性肌炎7例， 皮肌炎4例，干燥綜合征4例，系統性紅斑狼瘡3例。25例非結締組織疾病并發間質性肺病變患者，年齡26-80歲，平均 57.8±15.5 歲,其中男10例，女15例。非結締組織疾病組病種構成為：繼發于感染5例，藥物性 3例，胃食管反流 3例，原因不明 14例。兩組患者胸部CT影像主要表現：兩肺彌漫性分布的磨玻璃影、網狀陰影，有時可見牽引性支氣管擴張。另選取25例健康人作為正常對照組，年齡30-77歲，平均 52.2±15.7 歲，其中男13例，女性12例。結締組織疾病組3例、非結締組織疾病組2例患者采取淋巴細胞免疫分型血液標本前使用激素，其余患者及健康對照組均未使用糖皮質激素。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- PC5(貨號：6607013)；細胞裂解液：OptiLyse○RNO-lysing Solution(貨號：A11894)；流式細胞儀：Beckman Coulter FC500；以上所有試劑均購自美國Beckmen Coulter公司。

1.2.2血液樣本制備采集患者及正常健康人外周血2 ml，加入到EDTA抗凝的真空管中，混勻。取三只流式細胞儀上樣管，分別命名為同型對照管和實驗管1和實驗管2，每管中均加入100 μl抗凝全血，然后分別加入?20μl同型對照抗體和CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5抗體和CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5，充分混勻，避光室溫孵育15 min；然后向每管中加入紅細胞裂解液500 μl，充分混勻，避光孵育10 min后加入500 μl PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入500 μl鞘液，混勻，等待上機檢測。

1.2.3指標測定外周血淋巴細胞亞群及NK細胞檢測均采用流式細胞檢測技術，由我院中心實驗室專人操作檢測。

2結果

外周血T細胞各亞群檢測結果：結締組織疾病組與非結締組織疾病組相比，CD8+T細胞明顯增高(P<0.01);結締組織疾病組與正常對照組相比，CD8+T細胞也明顯增高,但CD56+數明顯降低,均P<0.05;非結締組織疾病組與正常對照組相比，外周血T細胞各亞群均無明顯差異。見表1。

表1　各組外周血淋巴細胞免疫分型結果比較±s)

注:與非結締組織疾病組比較，ΔP<0.05;與正常對照組比較，*P<0.05

3討論

急性間質性肺疾病或發作性間質性肺疾病病情進展迅速，死亡率高，短期內出現呼吸功能衰竭，做支氣管-肺泡灌洗液方面的檢查，病人及家屬難以接受，醫療風險也很大。尤其結締組織病患者出現急性間質性肺病變時,很難判斷是長期用激素或免疫抑制劑治療，合并了真菌、病毒感染；還是這類病人免疫功能異常用藥及飲食等因素出現過敏反應造成急性肺損傷，或是結締組織病急性活動期造成雙肺間質彌漫性病變，臨床上很難甄別這些情況。為了挽救病人生命，臨床上經常給予大劑量激素和抗真菌、抗細菌、抗病毒治療，由于治療用藥沒有準確的目標，不但造成治療費用高，而且還易出現各種藥物的不良反應，治療效果也很差。為提高對間質性肺病變患者的機體免疫狀態評估能力及免疫損傷是否參與患者肺間質病變炎癥反應過程的識別能力，本文對結締組織疾病組、非結締組織疾病組與健康人的外周血淋巴細胞免疫分型結果進行比較，研究結果顯示結締組織疾病組與非結締組織疾病組相比，CD8+T細胞明顯增高(P<0.01)，結締組織疾病組與正常對照組相比，CD8+T細胞也明顯增高(P<0.05)，非結締組織病組與正常對照組相比，CD8+T細胞無統計學差異。楊亞敏等研究結果顯示：高活動期系統性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血CD8+細胞百分率較穩定期明顯升高(P<0.01)；李昕等研究結果顯示：原發干燥綜合征患者外周血CD8+T 淋巴細胞水平明顯高于正常對照組(P<0.05) 和SLE 組(P<0.05),SLE 組外周血CD8+T 淋巴細胞水平也高于正常對照組(P<0.05)，CD8+細胞水平在疾病活動期明顯升高 。這兩項研究結果均提示結締組織疾病活動期外周血CD8+細胞水平明顯增高。本文結果表明結締組織疾病組合并間質性肺病變時，體內發生明顯的免疫功能紊亂，CD8+T細胞活化，提示CD8+T細胞在結締組織疾病肺免疫損傷過程中發揮重要的作用。因此，結締組織疾病合并間質性肺病變時，T淋巴細胞亞群的數量及功能改變可提示機體免疫功能異常，如果能在這個階段對機體的免疫學異常進行干預，則對改善結締組織疾病和肺部病變的治療效果和預后極其有利。

CD56分子是自然殺傷細胞 (NK細胞)表面主要的表面標記，NK細胞不僅是機體內的第一道免疫防御屏障，而且也具有免疫調節能力，NK細胞對T、B淋巴細胞、骨髓干細胞具有調控作用(免疫自穩)。本文研究結果顯示結締組織疾病組NK細胞數量明顯低于正常對照組，鄒原方等研究結果顯示SLE患者外周血CD3+CD56+自然殺傷T細胞的表達水平明顯低于正常對照組，該結果與本文一致[4]。Berzofsky等認為，NKT細胞是一種負向免疫調節細胞，能夠通過分泌IL-4 等細胞因子抑制免疫應答[5];Wermeling等研究結果顯示：在系統性紅斑狼瘡患者體內，iNKT細胞可以有效清除凋亡小體，進而抑制 CD1d+ 自身反應性 B淋巴細胞的激活[6],本文研究結果NK細胞數量下降是否提示結締組織疾病組機體B淋巴細胞產生自身抗體，是由于NK細胞數量下降，對T、B淋巴細胞調控作用減弱所致，還需進一步研究證實。

非結締組織疾病組與正常對照組相比，外周血T 細胞各亞群無明顯差異，提示不一定需要激素或免疫抑制劑控制炎癥反應，更應該積極尋找肺間質病變的原因，去除致病因素，給予相應治療。

總之，間質性肺病變患者的外周血T 細胞各亞群的變化令人關注,尤其是哪些間質性肺病變的重癥患者、臨床上難以實施支氣管-肺泡灌洗液方面的檢查，值得擴大樣本量進一步研究，以揭示外周血T淋巴細胞亞群檢測在彌漫性間質性肺疾病甄別肺損傷是否免疫損傷所致的作用，為指導治療方向提供實驗室依據。

參考文獻：

[1]李振華.支氣管-肺泡灌洗液檢查在彌漫性間質性肺疾病中的應用[J].現代實用醫學，2013，25(1)：2.

[2]朱元玨.間質性肺疾病的診斷和治療進展[J].臨床肺科雜志,2007，12(1)：1.

[3]中華醫學會風濕病學分會.風濕病新版全套指南.2012年2月18日修改版.

[4]鄒原方，羅婉瑩，郭少卿,等.系統性紅斑狼瘡患者外周血CD3+CD56+自然殺傷T細胞的表達及臨床意義[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(8):967.

[5]Berzofsky JA，Terabe M．NKT cells in tumor immunity：opposing subsets define a new immunoregulatory axis[J]．J lmmunol，2008，180(6)：3627．

[6]Wermeling F，Lind SM，Jordo ED，et al．Invafiant NKT cells limit activation of autoreactive CDld-positive B cells[J]．J Exp Med，2010，207(5)：943．

The clinical analysis of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping in interstitial lung lesionsLIUPei-pei1，JIANGYue-yao2，HOUSong-ping1*.(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,China-JapanUnionHospital,JiLinUniversity,Changchun130033,China；2.CollegeofPharmacy，JiLinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical value of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping and CD56+NK cell levels in interstitial lung disease due to connective tissue diseases or other causes.Methods50 patients with interstitial lung lesions，divided into connective tissue disease group，non-connective tissue disease group， 25 cases in each group.25 cases of healthy as the normal control.The levels ofCD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in the three groups were determined by a flow cytometry；compared differences between three groups of peripheral blood lymphocyte subsets.ResultsCompared with the non-connective tissue disease group，the levels of CD8+ cells in the connective tissue disease group were significantly higher (P<0.01);compared with the normal control group,the levels of CD8+ cells were also significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group(both P<0.05)；compared with the normal control group,the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious changes(P>0.05).ConclusionThe levels of CD8+cells in peripheral blood were significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group；the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious abnormal.It prompted that peripheral blood lymphocyte immunophenotyping helps to identify immune injury of the connective tissue disease complicated with interstitial lung disease.

Key words:Connective tissue disease;Non-connective tissue disease;Interstitial lung diseases;Lymphocyte subsets;NK cell

(收稿日期：2015-01-12)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R563.1

文章編號：1007-4287(2015)12-2066-03

*通訊作者