AMPK激活在抑制大鼠心肌細胞肥大中的作用

陳保林，俞杉，熊肇軍，張成喜，馬躍東，陳廣琴，劉晨，董吁鋼(貴州省人民醫院，貴陽 55000； 中山大學附屬第三醫院；中山大學附屬第一醫院)

AMPK激活在抑制大鼠心肌細胞肥大中的作用

陳保林1，俞杉1，熊肇軍2，張成喜2，馬躍東3，陳廣琴3，劉晨3，董吁鋼3(1貴州省人民醫院，貴陽 550002；2 中山大學附屬第三醫院；3中山大學附屬第一醫院)

摘要：目的探討單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)激活對抑制大鼠心肌細胞肥大的影響及其機制。 方法 分離培養新生大鼠心肌細胞，將培養的心肌細胞分為對照組、苯腎上腺素(PE)組、PA組、PAC組。PE組給予PE 10 μmol/L，PA組給予PE 10 μmol/L及AMPK激活劑5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)1 mmol/L，PAC組給予PE 10 μmol/L、AICAR 1 mmol/L及AMPK抑制劑Compound C 1 μmol/L。采用Western blot法檢測各組AMPK表達，高效液相色譜儀檢測各組心肌細胞三甲基組氨酸(3-MH)釋放量，實時熒光定量PCR法檢測各組ANP mRNA表達，采用免疫組化法測定各組心肌細胞表面積。 結果PE組3-MH釋放量低于對照組，PA組3-MH釋放量高于PE組，PAC組3-MH釋放量低于PA組(P均<0.01)。PE組ANP mRNA表達高于對照組，PA組ANP mRNA表達低于PE組，PAC組ANP mRNA表達高于PA組(P均<0.01)。PE組心肌細胞表面積大于對照組，PA組心肌細胞表面積小于PE組，PAC組心肌細胞表面積大于PA組(P均<0.01)。結論 AMPK在心肌肥大發生過程中具有重要作用，激活AMPK能夠促進心肌細胞蛋白質降解而逆轉心肌肥大，抑制AMPK則可促進心肌肥大的發展。

關鍵詞：單磷酸腺苷激活蛋白激酶；心肌細胞；肥大

心肌肥大是心肌細胞對機械張力及各種刺激的重塑反應，持續的肥大可顯著增加心力衰竭、惡性心律失常及心源性猝死的風險。心肌細胞肥大是細胞內蛋白質合成大于分解的外在表現，促進細胞內的蛋白降解過程是逆轉心肌肥大的新靶點。單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1]，對調控細胞生長、增殖和心肌細胞蛋白質代謝具有重要作用[2～4]。近年研究發現，AMPK對心肌肥大具有抑制作用，但機制尚未明確。2013年1月～2014年6月，我們采用AMPK激活劑5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)干預經苯腎上腺素(PE)誘導的大鼠肥大心肌細胞，觀察AMPK激活后對細胞內蛋白質降解的影響，探討AMPK激活后對逆轉心肌細胞肥大的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SD大鼠35只，日齡1～3 d，清潔級，由中山大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑及儀器DMEM/F12培養基；Ⅰ型膠原酶；胰蛋白酶；胎牛血清； PE； AMPK激活劑AICAR；AMPK抑制劑Compound C；小鼠抗大鼠α-actinin抗體(武漢博士德公司)；3-甲基組氨酸(3-MH)標準品(Sigma公司)；色譜純甲醇(天地公司)。倒置顯微鏡(Olympus公司)；高速冷凍臺式離心機(德國Heraeus公司)；熒光定量PCR儀；LC-20A高效液相色譜儀；C18色譜柱(日本GL Sciences公司)。

1.2實驗方法

1.2.1心肌細胞原代培養無菌條件下開胸取出35只大鼠的完整心臟，在超凈臺內去除心底結締組織和心房，剪開心室，將心室心肌組織剪碎成1 mm3大小，以0.05%Ⅰ型膠原酶消化，37 ℃恒溫槽輕輕振蕩2 h，之后以5倍于組織碎塊體積的0.125%胰酶消化2～3次，收集細胞懸液至含10%胎牛血清的培養基中，以200目篩網過濾后接種至培養瓶，置于37 ℃、5%CO2培養箱內60 min，差時貼壁法去除成纖維細胞。將心肌細胞以5×105/mL的密度接種于6孔板，加0.1 mmol/L BrdU以抑制成纖維細胞生長，加入青霉素及鏈霉素各100 U/mL防止細菌污染。培養48 h后待細胞生長融合成片，并出現同步收縮時，換成無血清的培養基，饑餓24 h后備用[5]。

1.2.2細胞分組及干預分離培養新生大鼠心肌細胞。將培養的心肌細胞分為對照組、PE組(PE 10 μmol/L)、PA組(PE 10 μmol/L + AICAR 1 mmol/L)、PAC組(PE 10 μmol/L + AICAR 1 mmol/L +Compound C 1 μmol/L)。PAC組先用Compound C預處理30 min后加入AICAR，30 min后再加入PE。

1.2.3相關指標觀察

1.2.3.13-MH釋放量采用高效液相色譜儀檢測心肌細胞3-MH釋放量，以評價心肌細胞內的蛋白降解情況。收集各組心肌細胞培養液至1.5 mL的離心管中，取0.5 mL樣品加入100 μL乙腈萃取，離心后取上清液100 μL加入衍生化試劑100 μL及0.4 mmol/L的硼酸緩沖液1 mL，用直徑0.22 μm的針頭過濾器過濾后立即進樣20 μL分析。用3-MH標準品準確配成一定濃度標準液，行5個梯度體積的標準液制作標準曲線。將樣品中3-MH的峰面積帶入，計算其水平。

1.2.3.2ANP mRNA表達以心肌細胞內胚胎基因ANP mRNA表達作為心肌肥大指標，采用實時熒光定量PCR法檢測各組ANP mRNA表達。干預6 h后用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，取RNA 1 μg為模板逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增。待測樣品均設置3個復孔進行檢測，ANP及GAPDH基因引物根據基因序列應用Primer premier 5.0軟件設計，由Invitrogen公司合成。序列如下：ANP上游：5′-GGAAGTCAACCCGTC-TCAGAGA-3′，下游5′-GAGCAGAGCCCTCAGTTTGC-3′；GAPDH上游：5′-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3′，下游5′-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3′。使用SYBR GREEN在Rotor-gene TM 6000熒光定量PCR儀上行實時熒光定量PCR檢測，反應條件為：94 ℃預變性2 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s共40個循環。反應結束后，使用PCR儀配套軟件分析，實時測定每個反應管內的熒光數值，各基因以相對量表示，重復測定3次，取其均值。

1.2.3.3心肌細胞表面積采用免疫組化法測定心肌細胞表面積。制作心肌細胞爬片，用4%多聚甲醛固定，再以3%H2O2孵育10 min，滴加α-actinin一抗(1∶200)4 ℃過夜。次日加生物素標記的二抗，室溫下孵育20 min后滴加鏈霉素抗生物素過氧化物酶，10 min后DAB顯色，鏡下觀察。在顯微鏡下對染色的心肌細胞拍照，各組隨機選取細胞邊界清晰的4個顯微鏡(400×)視野，測量100個細胞的表面積，取其均值，采用IPP 6.0軟件進行圖像分析。

2結果

2.13-MH釋放量PE組3-MH釋放量低于對照組，PA組3-MH釋放量高于PE組，PAC組3-MH釋放量低于PA組(P均<0.01)。見表1。

表1　各組心肌細胞3-MH釋放量、ANP mRNA

注：與對照組比較，*P<0.01；與PE組比較，#P<0.01；與PA組比較，△P<0.01。

2.2ANP mRNA表達PE組ANP mRNA表達高于對照組，PA組ANP mRNA表達低于PE組，PAC組ANP mRNA表達高于PA組(P均<0.01)。見表1。

2.3心肌細胞表面積PE組心肌細胞表面積大于對照組，PA組心肌細胞表面積小于PE組，PAC組心肌細胞表面積大于PA組(P均<0.01)。見表1。

3討論

心肌肥大是心臟對諸多外來刺激如高血壓、瓣膜性心臟病和心肌梗死等的一種反應。雖然肥厚過程被認為是一種代償性反應以降低室壁張力和氧耗，并維持正常心輸出量，然而持續的肥大是心腦血管事件的獨立危險因素。因此，積極控制心肌肥厚的發展，從而防治心力衰竭的發生發展，一直是臨床和基礎研究的熱點。近年來對心肌肥大發生機制的研究已取得了很大的進展，陸續發現了多條促肥大信號通路，包括磷酯酰肌醇3激酶-AKT(PI-3K-AKT)通路、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路和蛋白激酶C(PKC)通路等，這些促肥大信號通路被認為是抑制心肌肥大的有效靶點[6]。然而，由于促肥大信號通路過多而且肥大信號之間形成的復雜網絡，使得僅僅通過抑制促肥大信號往往對心肌肥大的治療效果欠理想[7]。因此，尋求新的更為有效的防治或逆轉心肌肥厚的新治療靶點具有重要價值。細胞大小取決于細胞內蛋白質合成與分解的動態過程，正常心肌細胞蛋白質合成與分解平衡過程受到嚴密調控[8]。心肌細胞肥大的本質是細胞內蛋白量的增加，因此，降解肥大心肌細胞內過多的蛋白質可達到逆轉心肌肥厚的作用。

AMPK是一種在真核細胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在AMP/ATP比例增加時發生磷酸化被激活，參與調節細胞內多種反應[9]。AMPK的下游靶蛋白主要與能量代謝調節有關，可啟動心肌細胞葡萄糖轉運體4(GLUT-4)基因的表達，誘導GLUT-4向漿膜轉移，從而加速細胞對葡萄糖的攝取，促進糖酵解，并抑制糖原合成；促進脂肪酸氧化，抑制膽固醇和脂肪合成；抑制蛋白質合成[10～12]。因此，AMPK通常被看做能量的測量器，根據各臟器系統的代謝需要，調節整個機體和細胞內能量利用[13]。但AMPK與心肌肥大是否有關及其在其中的作用尚不清楚。AICAR是AMPK激動劑，被心肌細胞攝取后可在腺苷激酶的磷酸化作用下生成5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸磷酸衍生物(ZMP)，發揮AMP樣作用激活AMPK，而不會改變細胞內AMP、ADP與ATP水平[14]。

3-MH是存在于肌動蛋白和肌球蛋白中的一類轉錄后修飾的氨基酸[15]，由于缺乏特異性的tRNA，肌肉蛋白質分解代謝時釋放的3-MH不能作為tRNA的底物參與新蛋白質的合成，因此，被認為是肌細胞蛋白質降解的生物學標志。在心肌細胞分解代謝過程中3-MH釋放增加，而在心肌細胞肥大過程中由于蛋白合成增加分解減少，故而3-MH釋放量減少。本研究發現，PE組3-MH釋放量低于對照組，PA組3-MH釋放量高于PE組，PAC組3-MH釋放量低于PA組，提示肥大心肌細胞的蛋白降解減少，AICAR可通過激活AMPK促進肥大心肌細胞蛋白降解從而減輕心肌肥大，而Compound C可阻斷AICAR促進蛋白降解的作用，減少蛋白降解，促進心肌肥大的發生。

在細胞水平，心肌細胞肥大除表現為細胞蛋白質量的增加外，還表現為細胞表面積增大與ANP再表達。胚胎基因ANP在心肌的再表達是心肌肥大的重要特征。本研究發現，PE組心肌細胞ANP mRNA表達量及心肌細胞表面積大于對照組，PA組心肌細胞ANP mRNA表達及心肌細胞表面積小于PE組，PAC組心肌細胞ANP mRNA表達及心肌細胞表面積大于PA組，提示肥大的心肌細胞ANP mRNA表達增加、心肌細胞表面積增加，AICAR可通過激活AMPK而降低肥大心肌細胞ANP mRNA的表達、減少心肌細胞表面積，從而減輕心肌肥大，Compound C則阻斷了AICAR對AMPK的激活，增加了ANP mRNA的表達及心肌細胞表面積，促進了心肌肥大。

綜上所述，AMPK在心肌肥大發生過程中具有重要作用，激活AMPK能夠促進心肌細胞蛋白質降解而逆轉心肌肥大，抑制AMPK則可促進心肌肥大的發展。本研究為心肌肥大的治療及研究提供了新思路，其具體分子機制尚需深入探討。

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Effect of AMPK activation in the inhibition of hypertrophy of rat cardiomyocytes

CHENBao-lin1, YU Shan, XIONG Zhao-jun, ZHANG Chen-xi, MA Yue-dong,

CHENGuang-qin,LIUChen,DONGYu-gang

(1ThePeople'sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550002,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activation in the inhibition of hypertrophy of rat cardiomyocytes in vitro and to investigate the underlying mechanisms. MethodsNeonatal SD rat cardiomyocytes were isolated and cultured. To observe the effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide-4-ribofuranoside (AICAR) and Compound C on the activation of AMPK, the cultured cells were divided into three groups: the control group, AICAR group(AICAR 1 mmol/L) and AICAR + Compound C group (AICAR 1 mmol/L + Compound C 1 μmol/L). To examine the effect of AMPK activation on hypertrophy of rat cardiomyocytes, the cultured cardiomyocytes were divided into four groups: the control group, phenylephrine group (PE 10 μmol/L), PA group (PE 10 μmol/L + AICAR 1 mmol/L) and PAC group (PE 10μmol/L + AICAR 1 mmol/L + Compound C 1 μmol/L). AMPK and p-AMPK protein levels in cardiomyocytes were detected by using Western blotting. High performance liquid chromatographic detection was used to determine the 3-methylhistidine (3-MH) concentration in medium. The mRNA expression of fetal gene atrial natriuretic peptide (ANP) was measured by real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). and the surface areas of cardiomyocytes was analyzed by immunohistochemistry. ResultsLevels of total AMPK protein of cardiomyocytes in each group showed no obvious changes. Compared with the control group, AICAR treatment up-regulated the p-AMPK protein level (P<0.01). Compared with the AICAR group, Compound C treatment down-regulated the p-AMPK protein level (P<0.05). Compared with the control group, the surface area of cardiomyocytes (P<0.01), and ANP mRNA expression (P<0.01) in the PE group was significantly increased; the 3-MH release in medium of cardiomyocytes in the PE group was significantly decreased (P<0.01). The 3-MH release was lower in the PE group as compared with the control group, the 3-MH release of the PA group was higher than PE group, PAC group was lower than that of the PA group (all P<0.01). The ANP mRNA expression in the PE group was higher than that of the control group, PA group was lower than the PE group, the PAC group was higher than the PA group (all P<0.01). The myocardial cell surface area of the PE group was greater than that of the control group, the myocardial cell surface area of the PA group was smaller than that of the PE group, the PAC group was greater than the PA group (all P<0.01).ConclusionAMPK plays an important role in the occurrence of myocardial hypertrophy, the activation of AMPK can improve protein degradation in cardiomyocytes to reverse the hypertrophy, and inhibiting AMPK can promote the development of myocardial hypertrophy.

Key words:adenosine monophosphate-activated protein kinase; cardiomyocytes；hypertrophy

(收稿日期：2014-11-20)

作者簡介：第一陳保林(1974-)，男，博士，副主任醫師，研究方向為心力衰竭的臨床與基礎研究。E-mail: chenbl104@163.com

基金項目：貴州省科技廳基金資助項目(黔科合J字[2011]2247號)。

中圖分類號：R364.3；R541

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)10-0017-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.006