宮頸癌組織中HMGB1、Notch1的表達及相關性

孫小云，張旭艷，閆雪，路中，陳昭日(濰坊醫學院臨床學院，山東濰坊6053；濰坊醫學院附屬醫院)

宮頸癌組織中HMGB1、Notch1的表達及相關性

孫小云1，張旭艷2，閆雪1，路中2，陳昭日2(1濰坊醫學院臨床學院，山東濰坊261053；2濰坊醫學院附屬醫院)

摘要：目的探討高遷移率族蛋白1(HMGB 1)及人跨膜蛋白Notch1在宮頸癌發病中的作用及相關性。方法 選擇子宮頸組織標本54例份，包括子宮頸鱗癌18例份(宮頸癌組)、子宮頸上皮內瘤變18例份(CIN組)、正常子宮頸組織18例份(對照組),采用Western blot方法檢測各組HMGB 1、Notch1蛋白的表達情況，采用線性相關分析法分析HMGB 1、Notch1蛋白在CIN及宮頸癌組織中的相關性。結果 宮頸癌組HMGB1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組HMGB1蛋白表達高于對照組(P均<0.05)。宮頸癌組Notch1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組Notch1蛋白表達高于對照組(P均<0.05)。CIN組HMGB1與Notch1蛋白表達呈正相關(r=0.96，P<0.05)，宮頸癌組HMGB1與 Notch1蛋白表達呈正相關(r=0.96，P<0.05)。結論 HMGB1、Notch1蛋白在CIN及宮頸癌組織中均表達增高，兩者在CIN及宮頸癌組織中的表達呈正相關，可能共同參與宮頸癌的發病。

關鍵詞：高遷移率族蛋白- 1；人跨膜蛋白Notch1；子宮頸上皮內瘤樣病變；宮頸癌

宮頸癌是我國婦女最常見的惡性腫瘤，且呈年輕化趨勢[1]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是DNA結合蛋白，參與了DNA復制、轉錄、翻譯，與惡性腫瘤的浸潤及轉移密切相關[2]。人跨膜蛋白Notch1是Notch信號通路中的重要成員，與腫瘤細胞的生長、新生血管形成有關，參與調控腫瘤細胞的增殖及凋亡等過程[3]。2013年10月～2014年10月，我們對宮頸癌組織中HMGB1及Notch1蛋白的表達進行檢測，探討HMGB1及Notch1蛋白在宮頸癌發病中的作用及相關性。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇濰坊醫學院附屬醫院新鮮子宮頸組織標本54例份，包括正常子宮頸組織(對照組)、子宮頸上皮內瘤變組織(CIN組)、子宮頸鱗瘤(宮頸癌組)各18例份。宮頸癌組均經病理檢查確診為宮頸鱗癌，年齡22～61(40.0±9.1)歲，根據FIGO2009年分期標準Ⅰ期10例、Ⅱ期8例，3例行筋膜外全子宮切除術，1例行行改良廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結切除術，14例行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結切除+腹主動脈淋巴結取樣術，術后病理檢查發現淋巴結轉移6例。CIN組年齡22～44(35.0±9.0)歲，其中CINⅡ12例、CINⅢ6例，18例患者中5例行全子宮切除術，1例宮頸冷刀錐切術，12例行宮頸LEEP切除術。選取因子宮肌瘤行子宮全切術患者的宮頸標本18例份作為對照組，年齡41～55(47.0±7.5)歲，取材前或手術前均無放化療史或局部治療史。

1.2HMGB1及Notch1蛋白表達檢測采用Western blot法。將組織標本置于冰上，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，提取上清，用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品20 μg行10%SDS-PADE電泳，恒壓90 V將蛋白轉至PVDF膜，轉膜時間1 h。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫搖床，封閉抗原2 h后分別放入TBST稀釋人抗HMGB1一抗(1∶1 000)及Notch1(1∶200)中，4 ℃冰箱孵育過夜，用TBST稀釋兔抗人IgG二抗(1∶2 500)室溫搖床2 h，ECL發光液反應15 min，在暗室中進行曝光顯影定影。以β-actin(1∶500)為對照。每組取5張顯影膠片置于掃描儀掃描，用Quntity one圖像分析軟件測定Western blot顯示條帶的光密度值(OD值)，以目的條帶與內參條帶OD值計算HMGB1及Notch1蛋白表達。人抗HMGB1多克隆抗體自Abcam公司)；人抗Notch1多克隆抗體購自Cell signaling；β-actin購自北京中山金橋生物技術公司；PVDF膜購自Millipore公司；即用型通用辣根過氧化物酶標記抗生物素IgG抗體購自Cell signaling；ECL反應底物購自Thermo公司；Tween-20試劑購自碧云天公司。

2結果

2.1HMGB1及Notch1蛋白表達宮頸癌組HMGB1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組HMGB1蛋白表達高于對照組(P均<0.05)。宮頸癌組Notch1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組Notch1蛋白表達高于對照組(P均<0.05)。見表1、圖1。

表1　三組HMGB1及Notch1蛋白表達

注：與對照組比較，*P<0.05。

注：左圖為HMGB1蛋白表達，右圖為Notch1蛋白表達。

圖1三組HMGB1及Notch1蛋白表達(Western blot)

2.2HMGB1與 Notch1表達的相關性CIN組HMGB1與Notch1蛋白表達呈正相關(r=0.96，P<0.05)，宮頸癌組HMGB1與 Notch1蛋白表達呈正相關(r=0.96，P<0.05)。

3討論

宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，患病率仍居我國婦女惡性腫瘤第1位。盡管宮頸癌篩查不斷普及，仍有大量中晚期患者未能經篩查發現，其腫瘤轉移是導致治療失敗的主要原因。宮頸癌的發生與多種癌基因和抑癌基因的表達、調控以及細胞凋亡有關。宮頸癌有較長的癌前病變階段，CIN是宮頸癌發生發展中的連續過程，約5%的高級別CIN可發展為浸潤癌。

HMGB1是含量最豐富的HMG蛋白，其基因定位于人染色體13q12，參與DNA的組成，調節DNA轉錄[3]。腫瘤侵襲過程中HMGB1可釋放至細胞外，與細胞表面的HMGB1受體高級糖基化終產物受體(RAGE)相結合形成HMGB1/RAGE復合物，激活絲裂原活化蛋白激酶、基質金屬蛋白酶、PI3K/Ak等信號通路，促進腫瘤新生血管形成、腫瘤浸潤及轉移[4]。研究表明，HMGB1在食管癌、胰腺癌、宮頸癌、結腸癌等腫瘤組織中表達增高，且HMGB1表達水平與腫瘤的發生階段相關，腫瘤發生早期HMGB1表達率為20%，而晚期表達率為80%[4]。研究發現，HMGB1表達水平與宮頸癌的轉移和復發密切相關，可作為預測宮頸癌復發及預后的指標[6]。HMGB1在正常宮頸鱗狀上皮、CIN組織、宮頸鱗癌組織中的表達也呈逐漸增高趨勢[5]。研究發現，阻斷宮頸癌細胞HMGB1基因表達后，宮頸癌細胞的增殖能力明顯降低，并可抑制宮頸癌細胞的侵襲及遷移[7]。本研究發現，宮頸癌組HMGB1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組HMGB1蛋白表達高于對照組，即HMGB1蛋白在惡性程度高的組織中表達較高， 提示HMGB1可能通過某種機制促進宮頸癌細胞的增殖、分化，導致腫瘤細胞的侵襲及轉移，在宮頸癌的發生、發展中起重要作用。因此，早期干預宮頸癌細胞中HMGB1的表達可能成為宮頸癌的治療靶點之一。

Notch信號通路參與細胞的分化、增殖及生存。Notch受體有四個類型，為Notch1～Notch4[8]。染色體易位可導致位于9號染色體上的Notch1基因斷裂，使Notch胞外區丟失，其胞內區獲得組成性活性而具有致癌作用[9]。研究發現，Notch1在CIN及宮頸癌組織中的表達增高，在宮頸癌發病過程中起重要作用[10,11]。Laura等[12]認為正常宮頸上皮發生癌變可能與Notch1蛋白的表達增高有關，從而導致宮頸癌的發生發展。本研究發現，宮頸癌組Notch1蛋白表達高于CIN組及對照組，CIN組Notch1蛋白表達高于對照組，提示Notch1的表達可能出現于宮頸癌惡性轉化的早期，可能具有促進癌前病變惡性轉化的作用。同時宮頸癌組Notch1蛋白表達高于CIN組，提示宮頸癌組織中Notch1基因具有促癌作用，Notch1可能是判斷宮頸癌惡變風險潛在生物學標記物之一。早期抑制Notch1蛋白的表達可能為宮頸癌的綜合治療提供新的思路。

本研究發現，CIN組HMGB1與Notch1蛋白表達呈正相關，宮頸癌組HMGB1與 Notch1蛋白表達也呈正相關，推測兩者可能共同作用調控腫瘤細胞的分化、增殖過程，共同影響宮頸癌細胞的分化、增殖，協同致病。但目前對兩者協同作用機制需進一步研究。

綜上所述，HMGB1、Notch1蛋白在CIN及宮頸癌組織中均呈高表達，二者表達呈正相關，可能共同參與宮頸癌的發生、增殖、浸潤過程，阻斷宮頸癌細胞中HMGB1、Notch1的表達可能成為宮頸癌新的治療靶點。

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(收稿日期：2014-12-02)

通信作者：陳昭日

基金項目：濰坊醫學院青年創新基金資助項目(K11QC1014)。

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)10-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.010