D2-40在肝細胞癌組織中的表達及其在淋巴轉移中的作用

張西坤，牛洪欣，徐忠法(山東省醫學科學院附屬醫院，濟南250031)

D2-40在肝細胞癌組織中的表達及其在淋巴轉移中的作用

張西坤，牛洪欣，徐忠法(山東省醫學科學院附屬醫院，濟南250031)

摘要：目的探討D2-40在肝細胞癌組織中的表達及其在淋巴轉移中的作用。方法選擇35例肝細胞癌患者的手術標本，其中伴淋巴結轉移9例、無轉移24例。分別取癌組織(肝癌組)、癌邊緣組織(癌邊緣組)及癌以遠(距腫瘤邊緣10 cm以上)正常組織(對照組)，采用SP免疫組化兩步法檢測三組D2-40表達，計數微淋巴管密度。結果D2-40的陽性表達主要分布于癌邊緣組織內淋巴管生長密集區。癌邊緣組發生轉移者D2-40陽性表達率高于無轉移者(P<0.05)。肝癌組未見明顯微淋巴管，微淋巴管主要分布于癌邊緣組及對照組。癌邊緣組淋巴結轉移者微淋巴管密度高于未轉移者(P<0.05)。結論 D2-40可促進肝細胞癌轉移，其機制為促進微淋巴管形成。D2-40表達可作為預測肝細胞癌淋巴結轉移的標記物。

關鍵詞：肝細胞癌；淋巴轉移；微淋巴管密度

肝細胞癌是原發性肝癌中最常見的一種類型，約占原發性肝癌的90%以上[1]。肝細胞癌容易發生淋巴轉移，研究淋巴轉移規律對于肝細胞癌的診斷及治療具有重要意義。D2-40是一種分子量為40 kD的唾液酸糖蛋白，可用于標記腫瘤組織中的淋巴管內皮，是新發現的判斷腫瘤組織是否發生轉移的特異性淋巴管標志物[2]。2011年1月～2013年6月，我們檢測了35例肝細胞癌組織中D2-40的表達，探討D2-40在肝細胞肝癌淋巴結轉移中的作用機制。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2011年1月～2013年1月在山東省醫學科學院附屬醫院手術治療的肝細胞癌患者手術標本35例份，每例份標本均包括癌組織(肝細胞癌組)、癌邊緣組織(癌邊緣組)及癌以遠(距腫瘤邊緣10 cm以上)正常組織(對照組)。患者中男30例、女5例，年齡41～72歲、中位年齡68歲。均經病理檢查確診。伴淋巴結轉移9例、無轉移24例。術前均未行任何抗腫瘤治療。所選病例均通過醫院倫理道德委員會的同意，并由患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2相關指標觀察

1.2.1D2-40表達將手術標本放入10%中性甲醛液固定，常規石蠟包埋，連續切片，厚度為4 μm，行SP免疫組織化學兩步法檢測三組標本中D2-40的表達。由兩位有經驗的病理科醫師采用雙盲法閱片，D2-40以細胞質呈棕黃色顆粒為陽性細胞，每例切片至少計數10個200倍視野，計數陽性細胞占所有細胞的百分數，陽性細胞數﹥25%為陽性，以陽性細胞數所占比例分為：﹤10%(-)，11%～25%(+)，25%～50%(++)，﹥50%(+++)。

1.2.2微淋巴管密度(MLVD) 將D2-40陽性的淋巴管腔視為微淋巴管，其管腔為棕黃色細長管壁包繞的條索狀或塌陷狀不規則形，內無紅細胞，由大且向腔內突出的單層內皮細胞構成。按照Choi等[3]方法由兩名診斷豐富的病理醫生按雙盲法先于低倍鏡(10×10)下全面觀察切片，確定淋巴管密度最高且染色清晰、背景對照良好的區域，再于高倍鏡(10×20)下計數微淋巴管數目。每例切片先后計數2次，記錄4個視野內的微淋巴管數，取其平均數。

2結果

2.1D2-40表達D2-40的陽性表達主要分布于癌邊緣組織內，淋巴管生長密集區。肝細胞癌組D2-40未見明顯陽性表達。癌邊緣組D2-40陽性表達率為77.14%，組內轉移、無轉移者陽性表達率分別為88.89%、79.17%，癌邊緣組發生轉移者D2-40陽性表達率高于無轉移者(P<0.05)。見表1。

表1　三組淋巴結轉移與未轉移者D2-40表達率

注：與同組轉移者比較，﹡P<0.05。

2.2微淋巴管密度肝細胞癌組未見微淋巴管分布。癌邊緣組織微淋巴管分布較密集，且管腔擴張。癌邊緣組、對照組微淋巴管染色清晰，微淋巴管呈擴張狀態，管壁薄而不規則，無平滑肌，管腔內未見紅細胞、偶見淋巴細胞，腫瘤細胞無染色。癌邊緣組微淋巴管計數為10.21±1.45，組內轉移與無轉移組微淋巴管計數分別為14.67±3.44、6.17±2.93，組內相比差異有統計學意義，P<0.05。見表1。

3討論

目前，我國肝細胞肝癌發病率逐年升高，但目前缺乏針對肝細胞癌特異性的早期診斷方法，且癌細胞容易通過血管、淋巴管發生肝內及淋巴轉移，因此深入研究肝細胞癌轉移的途徑、淋巴轉移的規律，對于提高肝細胞癌整體診治水平有著十分重要的意義。淋巴轉移是肝細胞癌轉移的主要途徑之一[4]，由于對肝細胞癌微淋巴管分布狀況及淋巴引流、腫瘤轉移途徑缺乏足夠的認識，腫瘤淋巴道轉移的機制目前仍不十分清楚，其中一個重要的問題是腫瘤組織中除了微血管外是否還存在微淋巴管，后者是否同微血管一樣，也為腫瘤提供了轉移通道，雖然淋巴管對腫瘤轉移的作用非常明顯，但由于缺乏適當的淋巴內皮特異性標記物和對淋巴管生成因子的認識，使得對腫瘤淋巴管生成的研究相對滯后。

淋巴轉移是導致肝細胞癌復發轉移的主要原因之一。據統計，肝細胞癌的淋巴轉移率為25.5 %～32.9 %[5，6]。由于缺乏鑒別淋巴管內皮細胞的特異性標記物，目前對腫瘤患者淋巴轉移的早期診斷尚較困難。D2-40 是一種新近被發現的分子量為40 kDa的淋巴管標記物，具有高度的特異性和敏感性[7]，其主要定位于淋巴管內皮細胞的細胞質及細胞膜上，個別可呈現由幾個內皮細胞構成的細胞簇或閉鎖的條索狀。D2-40在淋巴管瘤中陽性表達，在良性血管腫瘤中表達陰性，可用于微淋巴管及新生淋巴管的定位及定量觀察[8，9]。文獻報道[10～13]，D2-40在結直腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌等腫瘤組織中的表達量與淋巴結轉移、腫瘤分化程度、臨床分期等呈正相關。本研究發現，D2-40的陽性表達主要分布于肝細胞癌癌邊緣組織內，癌組織內無明顯表達，癌邊緣組織內淋巴管密度增大，可促使大量癌細胞進入淋巴管，發生淋巴轉移，提示常規檢查癌邊緣組織內微淋巴管密度可預測術后淋巴轉移。

淋巴轉移是肝細胞癌主要的轉移途徑之一，肝細胞癌淋巴轉移最容易累及肝門淋巴結。淋巴系統往往成為癌細胞潛伏、隱藏的主要場所，易導致術后復發轉移。目前有關腫瘤淋巴轉移的假說較公認的有兩種[14]，一種認為腫瘤周邊原有的微淋巴管結構不完整，可能導致腫瘤細胞容易進入淋巴管，發生淋巴轉移。另一種認為如同腫瘤微血管生成促進腫瘤生長的機制，腫瘤周圍同樣存在新生的微淋巴管，有助于腫瘤擴散至淋巴系統，發生淋巴轉移。Roma等[15]用D2-40標記前列腺癌中的微淋巴管，認為有淋巴轉移組癌旁組織的微淋巴管密度明顯高于無淋巴轉移組。Sedivy等[16]對口腔鱗狀細胞癌進行研究，表明微淋巴管密度與腫瘤的分級、淋巴轉移有關。

本研究發現，肝細胞癌組未見明顯微淋巴管，微淋巴管主要分布于癌邊緣組織及癌以遠正常組織，癌邊緣組微淋巴管密度明顯高于對照組及肝細胞癌組，考慮癌邊緣組微淋巴管密度增高，可能與以下因素有關：一方面不斷生長的癌細胞可能產生機械擴張力，導致癌組織內部間隙壓力升高，使微淋巴管萎縮、喪失功能；腫瘤細胞向四周侵襲生長的同時可能刺激癌邊緣組織分泌淋巴管生長因子，侵襲破壞癌組織微淋巴管，促使癌邊緣組織內微淋巴管的生長[17,18]，提示肝細胞癌淋巴結轉移過程中可伴隨著新生淋巴管的生成，D2-40可作為預測肝細胞癌淋巴結轉移的標記物。本研究發現，癌邊緣組發生轉移者D2-40陽性表達率高于無轉移者，淋巴轉移患者癌邊緣組的微淋巴管密度高于未轉移者，肝細胞癌組轉移與未轉移患者均未發現微淋巴管密度，提示肝細胞癌邊緣組織內微淋巴管密度增高可促進癌細胞通過淋巴轉移。

綜上所述，D2-40可促進肝細胞癌微淋巴管形成及淋巴轉移。D2-40的檢測可作為預測肝細胞癌淋巴結轉移的標記物。

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(收稿日期：2014-10-10)

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)10-0074-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.028