小擬南芥HDG12基因的克隆、生物信息學分析及植物表達載體的構建及植物表達載體的構建

梁志強　孔德真　李輝玲　裴娟　祝建波　王愛英

摘要：以小擬南芥基因組DNA為模板，運用同源克隆法獲得小擬南芥HDG12基因，命名為ApHDG12。運用生物信息學方法，對ApHDG12基因的理化性質、保守序列、二級結構、亞細胞定位等進行了分析，并進行同源建模。經測序和生物信息學軟件預測分析，結果顯示，ApHDG12基因由10個外顯子和9個內含子組成，mRNA長度為2 064 bp，編碼687個氨基酸，亞細胞定位于細胞核。系統進化樹顯示ApHDG12與Capsella rubella遺傳距離最近，CDD保守序列分析結果顯示ApHDG12有18～79位的同源異型域和206～436位的START結構域，屬于HD-zipⅣ類基因家族，同時構建了植物表達載體pBI121：：HDG12，轉化到農桿菌GV3101中，為進一步研究基因功能奠定基礎。

關鍵詞：小擬南芥；HDG12基因；克隆；生物信息學

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0033-05

收稿日期：2014-03-19

基金項目：石河子大學“自然科學與技術創新”團隊項目（編號：2011ZRKXTD-0605）。

作者簡介：梁志強（1988—），男，甘肅武威人，碩士，主要從事植物基因工程研究。E-mail：514326242@qq.com。

通信作者：王愛英，副研究員，主要從事植物基因工程與轉基因生物安全性評價研究。E-mail：way-sh@126.com。全球正面臨著水資源日益短缺的境況，由干旱造成的農作物減產及經濟損失逐漸加劇，因此甄別利用具有耐旱性的基因，提高作物的耐旱性，發展生物節水農業，對于緩解水資源危機，保障國家的糧食安全、生態安全和可持續發展具有重要意義。

擬南芥HD-zipⅣ類基因家族有16個成員，其中大部分在植物表皮層中表達，控制表皮細胞的分化、色素的合成、表皮毛和根毛的發育[1-2]。GL2在表皮毛部位表達，控制種皮、根毛以及莖葉表皮毛的發育[3]；ATML1和PDF2共同調節表皮的發育，若PDF2過量表達則影響花的形態以及開花時間[4]；ANTHOCYANINLESS2（ANL2）控制表皮層花青素的積累[5]；HDG11基因過量表達則會抑制表皮毛的分叉，且HDG11和HDG12基因共突變時這種現象更為明顯[1]，HDG11基因的過表達能夠提高植物的耐旱性[6]。前人針對HD-zip基因家族的研究結果表明，該家族內成員的功能較為復雜，在植物生長發育的過程中均發揮著重要作用，因此更深層次的研究其基因家族內成員的功能并加以合理利用具有十分重要的意義。

近年來，對擬南芥近緣種的研究已成為一個熱點，而新疆是擬南芥近緣種的分布中心[7]，小擬南芥（Arabidopsis pumila）是雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的近緣種，為十字花科擬南芥屬的短命植物，在適應新疆特殊干旱氣候方面，小擬南芥表現出更為優異的適應特性[8-9]。目前從小擬南芥中克隆得到了一些抗逆基因，與擬南芥有較高的同源性，如黃先忠等利用同源克隆法克隆的ApCBF1和AtCBF1編碼的氨基酸序列一致[10]；院海英等利用同源克隆法得到的ApNHX1與AtNHX1編碼的氨基酸序列比對結果為99%[9]；劉瑞娜等利用同源克隆法以AtHRD基因序列為模板設計同源引物克隆得到了小擬南芥ApHRD[11]。本研究以小擬南芥基因組DNA為模板，根據NCBI上HDG12基因序列設計同源引物，克隆得到了ApHDG12基因，并利用生物信息學軟件及在線序列分析工具，對其進行結構與功能預測，以期為后續開展的ApHDG12基因功能和作用機理研究提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1材料

小擬南芥種子由本實驗室保存，種植于“營養土 ∶蛭石=1 ∶2”的培養土中，置于20 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養。大腸桿菌TOP10、農桿菌GV3101，Taq DNA聚合酶購自天根公司，PMD18-T simple vector kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小擬南芥基因組DNA的提取采用CTAB優化法[12]提取小擬南芥基因組DNA。

1.2.2小擬南芥ApHDG12克隆及測序根據NCBI上已提交的擬南芥HDG12基因（NM_101655.2）cDNA序列，運用Primer 5.0設計同源引物（F：5′-AGTTGTGTGATGGTCCAGAGTTAGC-3′，R：5′-GATTTCTTACACTCTTTGCAGGCAT-3′），以小擬南芥基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系參考Taq DNA Polymerase說明書。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58.0 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸3 min 10 s，30個循環，72 ℃總延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，與PMD18-T simple vector于16 ℃過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）、X-gal（20 mg/mL）、IPTG（200 mg/mL）的LB平板上進行藍白斑篩選，對重組克隆進行PCR鑒定。陽性克隆交由北京華大基因公司進行測序。

1.2.3序列分析測序結果用DNAMAN 6.0進行拼接，用FGENESH（http：//linux1.sof tberry.com/berry.phtml）進行分析并預測蛋白的氨基酸序列，蛋白質理化性質預測用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，蛋白質親疏水性預測用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析，蛋白亞細胞定位預測分別采用WolfPsort（http：//wolfpsort.org/）[13]、BaCelLO（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello）、Cello（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）3種工具分析。

通過NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數據庫（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Str ucture/cdd/cddsrv.cgi）對ApHDG12蛋白序列的保守結構進行分析。運用NCBI的BlastP搜索與HDG12蛋白同源的其他植物序列，DNAMAN分析其相似性，使用MEGA5.2軟件Neighbor-Joining方法構建系統進化樹，Bootstrap分析次數為1 000次[14]。

利用在線工具HNN （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa _gor4.ht ml）對ApHDG12蛋白二級結構預測，螺旋卷曲（coiled-coil）預測用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分析。選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對ApHDG12蛋白構建三級結構模型[15]。

1.2.4植物表達載體構建測序正確的PMD18-T：：HDG12用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切得到的目的基因片段，同時用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質粒，切除GUS基因片段，回收表達載體大片段。將載體、片斷按1 ∶1比例，經T4連接酶4 ℃過夜連接，產物經熱激法轉化大腸桿菌Top 10感受態細胞。挑取菌斑在含有卡那霉素的液體LB培養基中，于 37 ℃、220 r/min振蕩培養5～6 h，進行PCR檢測，對陽性克隆提取質粒，進行酶切鑒定。BamHⅠ/SacⅠ酶切鑒定后得重組的植物表達載體命名為pBI121：：HDG12。

將酶切正確的質粒，電擊法轉化農桿菌GV3101，挑取單克隆進行PCR鑒定，保存鑒定正確的單克隆菌液。

2結果與分析

2.1小擬南芥HDG12基因的克隆和測序

經PCR擴增，電泳檢測得到3 000 bp左右的條帶（圖1），挑選其中2個單克隆進行測序，小擬南芥HDG12基因2條測序序列重復率為99.67%，與擬南芥HDG12基因比對，重復率為94.37%。測序分析PCR產物長度為3 034 bp，與預期結果相一致，命名為ApHDG12。

使用在線工具FGENESH對克隆到的ApHDG12基因組序列進行分析，得出ApHDG12基因包含10個外顯子、9個內含子（圖2），并預測ApHDG12基因mRNA的長度為2 064 bp，編碼687個氨基酸。

氨基酸序列比對結果（圖3）顯示，ApHDG12與AtHDG12氨基酸序列相似性為93.18%。共計45位氨基酸發生了變異。這些發生變異的氨基酸位點是否是小擬南芥特有，有待于進一步驗證。在幾個擬南芥近緣物種中的Homeodomain結構域中，ApHDG12第5位氨基酸突變為精氨酸R，在擬南芥及其近源物種中HDG12第5位為賴氨酸K，表明該結構域第5位的R是小擬南芥特有位點，預示著這一位的氨基酸在同源異型域中起著重要的作用。

2.2HDG12蛋白保守序列預測

使用NCBI 的 CDD（Conserved Domain Database）數據庫對FGENESH預測的ApHDG12氨基酸序列保守結構域進行分析，結果顯示，該序列具有典型的HD-zip轉錄因子結構特點（圖4），氨基酸序列18～79位是同源異型域（Homeodomain）；206～436位是START結構域（START domain）。

2.3蛋白質理化性質分析和亞細胞定位預測

使用Portparam分析小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列的理化性質，結果顯示，該序列的分子量為76 426.8 u，理論等電點為6.43，總負電荷殘基數目為74，總正電荷殘基數目為69，分子式為C3330H5304N950O1033S39，不穩定指數為5252，屬于不穩定蛋白，脂肪指數為81.32。

3種在線工具對ApHDG12亞細胞定位進行預測。WolfPsort預測結果顯示該蛋白定位于細胞核，Cello結果預測該蛋白定位于細胞核，可靠指數為2.694，BaCelLO預測結果該蛋白定位于細胞核，定位順序為：細胞內>細胞核或細胞質>細胞核。

2.4ApHDG12蛋白疏水性分析

用在線工具PortScale對小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列進行疏水性分析，窗口大小選擇9（圖5），結果表明，20位賴氨酸疏水性最弱，疏水指數為-3.944；341/342位半胱氨酸C/谷氨酸E 疏水性最強，疏水指數為1.956，多肽鏈整體表現為親水性，平均疏水性為-0.330。

2.5同源性和進化樹分析

在GenBank中輸入ApHDG12氨基酸序列，運行BlastP，結果顯示，該氨基酸序列已在蓖麻、毛果楊、Capsella rubella（與擬南芥近緣的薺菜屬一個自交物種）、Eutrema salsuginuem、擬南芥、陸地棉、葡萄、玉米、可可、高粱、山羊草、碧桃等物種里報道過。運行DNAMAN對氨基酸序列進行比對，結果顯示，AtHDG12基因編碼的氨基酸序列與高粱（Sorghum bicolor；XP_002438026.1）的同源性是50.48%；與碧桃（Prunus persica；EMJ18783.1）的同源性是43.34%；與山羊草（Aegilops tauschii；EMT05677.1）的同源性是45.60%；與Eutrema salsugineum（ESQ35009.1）的同源性是85.71%；與無油樟（Amborella trichopoda；ERN11049.1）的同源性是56.88%；與玉米（Zea mays；AFW73676.1）的同源性是49.93%；與可可（Theobroma cacao；EOY01444.1）的同源性是44.43%；與葡萄（Vitis vinifera；CAN83483.1）的同源性是63.64%；與毛果楊（Populus trichocarpa；ERP52009.1）的同源性是62.92%；與陸地棉（Gossypium hirsutum；AAU12247.1）的同源性是65.33%；與蓖麻（Ricinus communis；XP_002527933.1）的同源性是62.15%；與擬南芥（Arabidopsis thaliana；NP_564041.2）的同源性是9318%；與Capsella rubella（EOA39819.1）的同源性是93.03%。

應用MEGA5.2軟件對13個物種的HDG12氨基酸序列進行系統進化分析，結果顯示，小擬南芥與Capsella rubella、 Eutrema salsuginuem、擬南芥遺傳關系最近，與Capsella rubella聚為一類（圖6）。

2.6ApHDG12蛋白二級結構預測

利用在線工具HNN對ApHDG12蛋白二級結構進行預測，結果顯示，ApHDG12多肽鏈有α螺旋殘基206個，占二級結構29.99%；β折疊殘基133個，占19.36%；無規則卷曲殘基348個，占50.66%。利用PSIPRED分析顯示該蛋白擁有19個α螺旋，15個β折疊，無規則卷曲34個（圖7）。運用COILS對ApHDG12編碼的氨基酸序列進行卷曲螺旋（coiled-coil）預測（圖8），結果顯示，第一個coiled-coil模式序列位于31～45區域；第二個coiled-coil模式序列位于47～61區域；第三個coiled-coil模式序列位于69～111區域。

2.7ApHDG12蛋白三級結構同源建模

選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對ApHDG12蛋白建模，用DeepView觀察其結果，發現該蛋白由兩部分結構域組成（圖9），第一部分由18～79位氨基酸組成的同源異型結構域（homeodomain）（圖10-A），以雞engrailed 2 homeodomain蛋白同源異型結構域為模板；第二部分由206～436位氨基酸組成的START結構域，以人類類固醇合成急性調節蛋白（human phosphatidylcho line transfer protein）START結構域為模板（圖10-B）。

2.8植物表達載體的構建

為模板，克隆得到兩端帶有酶切位點的基因片段，克隆方法同上。將該質粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切回收基因片段，同時BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質粒，回收載體大片段，經T4連接酶連接的產物轉化大腸桿菌TOP10感受態，PCR鑒定后，質粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切進行鑒定，酶切產物在3kb處，即為插入的目的基因片段（圖11），表明植物過表達載體已構建成功。該植物表達載體包括完整的NPTⅡ篩選標記，CaMV 35S啟動子，NOS終止子（圖12）。

2.9pBI121：：HDG12轉化農桿菌

將酶切驗證正確的pBI121：：HDG12質粒，電擊法轉化農

桿菌GV3101細胞，涂布于含有利福平（100 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的固體LB培養基上，28 ℃培養36 h后，挑取單克隆，PCR鑒定，擴增片段與PMD18-T：：HDG12擴增條帶一致（圖13），證明pBI121：：HDG12植物表達載體已經轉入了農桿菌GV3101中。

3結論與討論

干旱是影響全世界農業可持續發展的一個重要問題。利

用轉基因方法培育耐旱作物品種是實施農業節水的一個重要途徑，具有周期短、資源豐富的優勢。近年來，越來越多的同源異型域——亮氨酸拉鏈基因被克隆，并證實具有特殊的功能。

棉花GbML1屬于HD-zipⅣ基因家族，NM端的同源異型域（HD）和不完整的亮氨酸拉鏈結構（LZL）專一的L1盒，控制LI層相關基因的表達。START結構域和SAD結構域共同完成與GbMYB25蛋白的結合，經采用片段缺失法，通過酵母雙雜交手段驗證，只有完整的START結構域和SAD結構域存在時，GbML1蛋白和GbMYB25蛋白才能相互作用[16]，說明HD-zipⅣ蛋白的HD-LZL結構專一結合DNA結合位點，START-SAD結構與相關蛋白結合，行使特定功能。

AtHDG12基因在突變時，擬南芥表現出與野生型相同的表型，表明了AtHDG12為冗余基因；與AtHDG11基因雙突變時表現出了比野生型和AtHDG11單突變時更為顯著的表型—表皮毛分支數明顯增加，多于野生型和HDG11基因單突變時的表皮毛分支數[2]，有可能暗示著HDG12基因與HDG11基因在植物中表達調控時具有相互作用。AtHDG11過表達使得擬南芥和煙草都表現出氣孔密度降低、主根增長和側根數量增加的表型，提高了擬南芥和煙草的耐旱性[6]。AtHDG12和AtHDG11為一對等位基因，是否AtHDG12也具有類似于AtHDG11一樣的功能尚不明確，有待于實驗驗證。

我們從小擬南芥中克隆得到了ApHDG12，對其進行生物信息學分析，發現ApHDG12具有HD-zip基因家族的特征，在氨基酸的理化性質方面二者存在明顯的差異，在homeodomain域中的第5位氨基酸發生了變異，是否是這一位的氨基酸突變會改變蛋白功能，還需要進一步的實驗證明，同源性分析其與擬南芥近緣種Capsella rubella親緣關系最近，次之為擬南芥。卷曲螺旋預測，在homeodomain結構域中存在3個卷曲螺旋結構，與homeodomain結構域功能相符合，ApHDG12氨基酸序列不論從保守序列預測還是三級結構建模預測，只預測到了同源異型域和START結構域，不完整亮氨酸拉鏈結構（LZL）和SAD結構域沒有預測到，也許是因為生物信息學在線分析工具存在一定局限性，不能完整預測蛋白結構。同時我們構建了pBI121：：HDG12植物表達載體，轉化了農桿菌GV3101，為我們后續將該基因轉化模式植物擬南芥和煙草分析其功能提供了依據。

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