鐵炮百合離體再生體系的建立

向地英　薛木易　鄒麗紅

摘要：以鐵炮百合無菌苗的葉片、鱗片為外植體，進(jìn)行鐵炮百合再生體系的研究。結(jié)果表明：鱗片的誘導(dǎo)分化能力高于葉片，鱗片分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的分化率高達(dá)90.98%。用葉片為外植體，不同部位對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響較大，以葉片中部分化能力最強(qiáng)，上部次之，下部最差。葉片分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，分化率為85.36%。2，4-D濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響顯著，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D為佳，愈傷率達(dá)80%以上。

關(guān)鍵詞：鐵炮百合；離體再生；鱗片

中圖分類號(hào)： S682.2+65.04+3；Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0055-03

收稿日期：2014-10-13

基金項(xiàng)目：河北省保定市科技項(xiàng)目（編號(hào)：12ZF073）。

作者簡介：向地英（1978—），女，重慶云陽人，博士，講師，主要從事觀賞植物抗逆生理研究。E-mail：43823526@qq.com。鐵炮百合（Lilium longifllorum）原產(chǎn)于我國臺(tái)灣，是重要的切花材料，其花朵極香，含有芳香油，可作香料，具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)因周期長，短期內(nèi)無法培育出新的品種以滿足需求。植物的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)通過抑制內(nèi)源基因或?qū)胪庠椿蚨ㄏ蚋脑熘参镄誀睿黄屏宋锓N間的界限，創(chuàng)造出新種質(zhì)，大大縮短育種進(jìn)程。高效離體再生是轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。近年來，很多學(xué)者選用珠芽、幼莖段、葉片、鱗片等不同外植體嘗試百合的組織培養(yǎng)[3-5]。關(guān)于鐵炮百合的高效再生報(bào)道較少。本試驗(yàn)以鐵炮百合組培苗葉片為材料，對(duì)不同外植體、不同激素配比進(jìn)行研究，選出誘導(dǎo)愈傷、分化不定芽能力高的培養(yǎng)基類型，建立鐵炮百合高效離體再生體系，旨在為鐵炮百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為鐵炮百合無菌苗。

1.2方法

1.2.1不定芽的增殖取長3～5 cm的不定芽接種于繼代培養(yǎng)基MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中，附加蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx（約1個(gè)月繼代1次）。

1.2.2再生苗小鱗片、葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的預(yù)篩選取再生小植株小鱗莖上的外層鱗片及葉片，接種在不同濃度激素組合的分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+6-BA（0、0.5、1.0） mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L、MS+6-BA（05、1.0） mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 6 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，光照周期 12 h/d，光照度2 000 lx，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷分化情況。

1.2.3葉片不同部位的誘導(dǎo)能力切取葉片上、中、下3段，在相同培養(yǎng)基類型及相同環(huán)境條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基類型為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀察其生長情況。

1.2.4再生苗鱗片的分化能力將再生植株苗上的小鱗片放在MS+（0.5、1.0、2、5、10） mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度 （25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx，定期觀察其生長情況。

1.2.5不同濃度2，4-D對(duì)葉片基部誘導(dǎo)分化能力的影響切取葉片的基部接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+（0.2、3.0） mg/L 2，4-D、MS+（0、1.0） mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D、MS+3.0 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基內(nèi)暗培養(yǎng)，定期觀察其生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1鱗片、葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基預(yù)篩選

以分化率、誘導(dǎo)率、生長勢(shì)為指標(biāo)篩選出適宜的培養(yǎng)基，比較鱗片與葉片的誘導(dǎo)分化能力。鱗片的誘導(dǎo)分化能力明顯高于葉片。鱗片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基為佳，葉片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基為佳。

2.2葉片不同部位誘導(dǎo)分化能力比較

葉片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，葉片邊緣出現(xiàn)少量愈傷組織，20 d后愈傷組織表面出現(xiàn)白色芽點(diǎn)，再經(jīng)過一段時(shí)間，芽點(diǎn)處形成大小、長短不一的不定芽，不定芽均為白色（圖1）。葉片不同部位分化能力不同，葉片中部分化率最高，上部次之，下部分化率最低（表1）。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基對(duì)葉片誘導(dǎo)分化能力強(qiáng)。

2.3不同激素配比對(duì)鱗片分化的影響

以分化率、叢芽數(shù)及芽生長勢(shì)為指標(biāo)， 調(diào)整6-BA、NAA

的比例，篩選出最適合誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基，鱗片在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，鱗片基部膨大，15 d后，可見嫩綠色的芽點(diǎn)，25 d后，芽點(diǎn)處形成大小、長短不一的不定芽或叢芽。50、10 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中外植體變化緩慢，其中以10 mg/L 6-BA最慢，30 d后仍只見鱗片基部膨大，60 d后其芽分化量少且矮。綜合不定芽生長情況可知，0.5、1.0 mg/L 6-BA等2種培養(yǎng)基較適宜（表2、圖2）。

2.42，4-D濃度對(duì)葉片分化能力的影響

2，4-D既可以誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚的發(fā)生，也可以抑制體細(xì)胞胚的發(fā)育。本試驗(yàn)中，在僅有2，4-D作為誘導(dǎo)分化激素的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)率都不高。培養(yǎng)75d后，除了2，4-D表160 d鐵炮百合不同部位葉片分化能力0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L培養(yǎng)基上有分化外，其余4種培養(yǎng)基均不分化不定芽（表3）。培養(yǎng)10 d后，基部葉片略微膨大，20 d后其上出現(xiàn)少量的愈傷組織，愈傷組織數(shù)量逐漸增多，愈傷組織塊逐漸增大（圖3、圖4）。

2.5暗培養(yǎng)與光培養(yǎng)對(duì)葉片分化能力的影響

光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)對(duì)鐵炮百合葉片的分化有明顯影響。在相同的培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)的不定芽分化率顯著高于光培養(yǎng)，且暗培養(yǎng)比光照條件下培養(yǎng)葉片分化叢芽數(shù)多，芽也更健壯。所以，暗環(huán)境比光照環(huán)境更有利于葉片分化不定芽。

3結(jié)論與討論

有研究表明，NAA 與 6-BA 組合對(duì)很多百合品種的不定芽誘導(dǎo)效果較好[6-7]。較高濃度的分裂素與較低的生長素可以促進(jìn)不定芽的分化[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度6-BA下鱗片分化率顯著高于10 mg/L 6-BA 鱗片 的分化率，10 mg/L 6-BA培養(yǎng)基誘導(dǎo)的不定芽數(shù)少，誘導(dǎo)率低，且長勢(shì)較弱，可能是因?yàn)檫^高的6-BA 抑制了不定芽的分化。以往鐵炮百合組織培養(yǎng)中，多數(shù)學(xué)者采用鱗片作為外植體，但由于鱗莖長期生長在土壤中，導(dǎo)致病原菌多，以致外植體很難徹底消毒。以葉片或花部等組織作為外植體可以大大降低污染率。

驗(yàn)結(jié)果還表明，葉片不同位置的再生率不同，中部分化不定芽的能力最強(qiáng)，達(dá)85.36%，這與王杰等的結(jié)論[9]類似。光照條件對(duì)外植體分化有很大影響。曹孜義等認(rèn)為，有的材料適合暗培養(yǎng)，有的適合光培養(yǎng)，暗光更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)形成[10]。王杰等認(rèn)為，光培養(yǎng)對(duì)麝香百合胚性愈傷組織長勢(shì)、體積增長、增殖系數(shù)有顯著的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中，暗培養(yǎng)比光照條件更有利于鐵炮百合葉片誘導(dǎo)不定芽。2，4-D常用于誘導(dǎo)愈傷組織與促進(jìn)其生長[11]。在2，4-D對(duì)葉片分化的誘導(dǎo)試驗(yàn)中，2，4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)80%，遠(yuǎn)高于其他濃度組合。本試驗(yàn)利用2，4-D誘導(dǎo)的葉片形成愈傷組織，不能分化不定芽，可能由于2，4-D抑制體細(xì)胞胚的發(fā)育所致[12]。綜上所述，鐵炮百合鱗片的誘導(dǎo)分化能力高于葉片，鱗片分化培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為宜。葉片分化培養(yǎng)基以MS+1.0 mg/L BA+ 0.2 mg/L NAA為宜。葉片的不同部位對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響較大，以葉片中部分化能力最強(qiáng)，分化率為82.36%，上部次之，下部最差。2，4-D濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著影響，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D 為佳，愈傷率達(dá)80%以上。

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