木霉菌分離培養(yǎng)基的優(yōu)化及對黃萎病的拮抗篩選

劉政　孫艷　張學坤　陳兵

摘要：為了確定適合從土壤中分離木霉菌的培養(yǎng)基，設計5種不同的組合配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，土壤稀釋10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基分離土壤，能夠減少菌落重疊，使菌落容易辨別，適合木霉菌的分離；經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)，篩選出4株對棉花黃萎病具有拮抗作用的木霉菌，分別為T1、T10、T25、T34，其生長速率分別是棉花黃萎病菌的7.89、7.92、7.87、7.76倍。

關鍵詞：木霉菌；培養(yǎng)基；黃萎病菌；拮抗篩選

中圖分類號：S435.621.2 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0121-03

收稿日期：2014-03-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360452、41161068）；兵團技術轉移項目（編號：2012BD057）；兵團青年創(chuàng)新基金（編號：2011CB001）。

作者簡介：劉政（1979—），男，安徽阜陽人，碩士，助理研究員，主要從事棉花病害生物防治方面的研究。Tel：（0993）6683537；E-mail：lzh8200@126.com。土壤是微生物生存的大本營，木霉菌是土壤中普遍存在的一類真菌，屬于半知菌類絲孢目叢梗孢科木霉屬（Trichoderma spp.）[1]。它可以產(chǎn)生一些抗生物質并寄生在其他真菌上[2-3]，與其他微生物形成空間或營養(yǎng)上的競爭關系[4-6]，能夠抑制或降解某些病原物為侵入植物而分泌的果膠酶和其他酶類的合成[7]；此外，還與植物建立協(xié)同共生的關系，并能誘導植物抗性、激發(fā)植物防御反應機制等[8]。目前，木霉菌作為生物防治的優(yōu)勢菌在植病生防中的應用潛力越來越受到重視，而木霉菌在從土壤分離培養(yǎng)的過程中因土壤微生物種類較多、群落結構復雜，極易漏篩掉優(yōu)良的木霉菌株，所以選擇適合木霉菌分離的培養(yǎng)基非常關鍵。本研究設計5種不同配方的培養(yǎng)基和不同的稀釋濃度，利用新疆兵團棉花黃萎病嚴重發(fā)病的土壤為研究材料，找到適合木霉菌分離的培養(yǎng)基和稀釋濃度，篩選出拮抗性強的木霉菌并研究其對棉花黃萎病菌的拮抗作用，為今后從土壤中大批量地篩選木霉菌提供一套可行的方法，同時篩選獲得的木霉菌株為今后開展小區(qū)試驗和田間試驗提供基礎條件。

1材料與方法

1.1木霉菌分離培養(yǎng)基的配制

1.1.1木霉菌基礎分離培養(yǎng)基（1）PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、葡萄糖30.0 g、瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min備用。（2） TSM培養(yǎng)基。K2HPO4 0.9 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KCl 0.15 g、NH4NO3 1.0 g、葡萄糖3.0 g、孟加拉紅0.15 g、60%敵克松可濕性粉劑0.3 g、五氯硝基苯（PCNB） 0.2 g、瓊脂20.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL ，121 ℃滅菌20 min，用之前加入100 mg/L氯霉素。

1.1.2木霉菌改良分離培養(yǎng)基設置TSM培養(yǎng)基、TSM培養(yǎng)基+0.08 g/L三唑酮、PDA+0.15 g/L孟加拉紅、PDA+015 g/L孟加拉紅+0.2 g/L PCNB、PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L PCNB+0.08 g/L三唑酮5種培養(yǎng)基。

1.2木霉菌分離培養(yǎng)基和稀釋濃度的篩選

采集來自于不同地區(qū)的10份土樣，用以上5種培養(yǎng)基分離木霉菌，設置3個稀釋濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，根據(jù)分離篩選結果，選出最佳分離培養(yǎng)基和稀釋濃度。

稀釋平板法：稱取土樣10 g，放入裝有90 mL滅菌蒸餾水及小玻璃珠的250 mL三角瓶中，在搖床上以120 r/min搖 10 min，使土樣充分分散，即成10-1倍稀釋液；再吸取攪拌中的10-1倍稀釋液1 mL移入裝有9 mL滅菌蒸餾水的試管中，即成10-2倍稀釋液；依此制成10-3倍稀釋液（注意：每次一定要更換試管，連續(xù)稀釋）。將融化的選擇性培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒入15 mL。待培養(yǎng)基冷卻成平板后，用無菌吸管按無菌操作過程分別吸取土樣的10-3稀釋液0.1 mL，于分離時用在培養(yǎng)基平板上，再用無菌刮鏟將稀釋液涂勻后培養(yǎng)，每個稀釋濃度重復3次，置于培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，待72 h后觀察菌落，選定特征菌落，挑菌絲于新培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。

1.3木霉菌株拮抗作用的初步研究

1.3.1平板對峙拮抗試驗[9]將待測木霉菌與棉花黃萎病菌同步活化后，棉花黃萎病菌提前7 d接種于PDA平板上對峙培養(yǎng)，然后在黃萎病菌落對面接種木霉菌，平板直徑為 90 mm，兩菌間接種距離為50 mm，3 d后觀察營養(yǎng)競爭情況，隨后每天觀察有無重寄生現(xiàn)象或抑菌現(xiàn)象，并記錄拮抗情況。

1.3.2拮抗優(yōu)勢菌株與棉花黃萎病的生長速率觀察將培養(yǎng)好的黃萎病菌和木霉菌打成直徑均為5 mm的菌餅，分別接入直徑為70、200 mm的PDA培養(yǎng)皿中心，置于27 ℃培養(yǎng)箱中生長，每天測量菌落直徑，連續(xù)觀察5 d后結束，比較木霉菌和黃萎病菌的生長速率。

2結果與分析

2.1木霉菌分離培養(yǎng)基和稀釋倍數(shù)的篩選

培養(yǎng)基中PCNB對絲核菌及部分放線菌有抑制效果；孟加拉紅對細菌有廣譜抑制作用；適量的三唑酮能刺激孢子萌發(fā)，增加分生孢子產(chǎn)量，有效抑制輪枝菌生長；TSM培養(yǎng)基本身含有氯霉素、孟加拉紅、敵克松、PCNB等多種抑菌成分。

由表1可知，稀釋濃度為10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基中分離出的微生物數(shù)量較多，個別為細菌，絕大多數(shù)為木霉菌等真菌，易鑒別，有利于挑取菌絲、單孢分離等操作。而其他配方培養(yǎng)基和稀釋濃度的分離效果均不理想，因此，選擇稀釋濃度為10-1 的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基來進行本試驗中木霉菌分離培養(yǎng)，經(jīng)過分離得到了38株木霉菌菌株。表1細菌培養(yǎng)基的篩選結果

培養(yǎng)基配方稀釋濃度菌落生長情況TSM培養(yǎng)基10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，少量為木霉等真菌10-2分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，個別為木霉等真菌10-3分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細菌，木霉菌等真菌數(shù)量少TSM培養(yǎng)基+0.08 g/L三唑酮10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，少量為木霉等真菌10-2分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細菌，木霉菌等真菌數(shù)量少10-3分離出的微生物數(shù)量極少，多數(shù)為細菌，個別為木霉菌等真菌PDA+0.15 g/L孟加拉紅10-1分離出的微生物數(shù)量較多，個別為細菌，絕大多數(shù)為木霉菌等真菌，有易于鑒別，利于挑取菌絲、單孢分離等操作10-2分離出的微生物數(shù)量極少，大量木霉菌等被抑制，無法分離出來10-3只分離出個別真菌微生物，木霉菌等幾乎全部被抑制，無法分離出來PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L10-1分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，少部分為木霉等真菌PCNB10-2只分離出個別微生物，大量微生物無法分離出來10-3幾乎無法分離出微生物PDA+0.15 g/L孟加拉紅+0.2 g/L 10-1分離出的微生物數(shù)量很多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，個別為木霉等真菌PCNB+0.08 g/L三唑酮10-2分離出的微生物數(shù)量較多，菌落重疊嚴重，大部分為細菌，少量為木霉等真菌10-3分離出的微生物數(shù)量較少，多數(shù)為細菌，木霉菌等真菌數(shù)量少，無法分離出來

2.2木霉菌株拮抗作用的初步研究

木霉菌對棉花黃萎病菌的拮抗作用主要有營養(yǎng)競爭、重寄生作用、抗生作用。經(jīng)過對峙拮抗篩選發(fā)現(xiàn)，木霉菌株T1、T10、T25、T34具有明顯的營養(yǎng)競爭和重寄生作用，具體結果如圖1所示。由圖1可知，提前7 d接種棉花黃萎病菌，可讓黃萎病菌落生長至一定的菌落大小，然后在其對側接種木霉菌，結果發(fā)現(xiàn)4種木霉菌生長速度很快，能快速占據(jù)生存空間和爭奪養(yǎng)分，而棉花黃萎病菌生長速度較慢，且受到明顯的抑制，因為木霉菌的拮抗作用除了空間競爭作用外，還有重寄生作用和溶菌作用。

2.3拮抗優(yōu)勢菌株與棉花黃萎病的生長速率觀察

由圖2可知，將木霉菌T1與棉花黃萎病菌H5-1同時接入PDA培養(yǎng)基后，木霉菌生長迅速，初期菌絲為白色，3 d后出現(xiàn)同心輪紋狀現(xiàn)象，5 d后幾乎布滿整個培養(yǎng)皿，其菌落直徑是棉花黃萎病菌的7.89倍。

將篩選出來的木霉菌T10、T25、T34生長速率與棉花黃萎病菌H5-1進行比較，也表現(xiàn)出木霉菌生長速率很快而黃萎病菌生長速率緩慢的現(xiàn)象，到培養(yǎng)后5 d時，各菌株的生長速率分別是棉花黃萎病菌的7.92、7.87、7.76倍。

3小結

土壤中微生物種類多，如果不選擇合適的培養(yǎng)基則很難從土壤中分離出各種木霉。因此，分別以TSM培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，設計5種不同配方的木霉菌培養(yǎng)基，來篩選分離木霉菌的最適培養(yǎng)基和最佳稀釋濃度。TSM培養(yǎng)基本身含有氯霉素、孟加拉紅、敵克松、PCNB等多種抑菌成分，具有較強的抑菌效果，對木霉菌也產(chǎn)生了一定的抑制作用，分離效果不佳；選用的孟加拉紅+PDA 培養(yǎng)基減少了菌落重疊，使菌落容易辨別，根據(jù)稀釋濃度來看，發(fā)現(xiàn)稀釋10倍有利于木霉菌株的分離，因此最后確定土壤稀釋10倍后用改良的PDA+0.15 g/L孟加拉紅培養(yǎng)基能達到最佳分離效果，將得到的木霉菌株進一步進行拮抗試驗，從而得到4株分離純化的木霉菌。

在本試驗中，木霉菌對營養(yǎng)和空間具有強烈的競爭能力，對病原菌的拮抗作用表現(xiàn)為生長迅速并覆蓋黃萎病菌，纏繞在菌絲體上，使黃萎病菌菌落塌陷、解體分離等現(xiàn)象，說明4種木霉菌對棉花黃萎病菌都有一定程度的拮抗作用；進一步考察其生長速率，發(fā)現(xiàn)木霉菌菌落生長繁殖擴散很快，5 d后的生長速率是黃萎病菌的7～8倍，這可能是因為木霉菌在短期內(nèi)大量繁殖，吸收大量的營養(yǎng)，通過營養(yǎng)競爭來拮抗黃萎病菌，從而達到防控棉花黃萎病的效果。不過土壤中微生物群落復雜，土壤中pH值、腐植酸和其他各種因子對木霉菌影響很大，單純的平板對峙培養(yǎng)結果并不能完全反映木霉菌對棉花黃萎病的實際防治效果，因此獲得的拮抗木霉菌株在田間的防治效果還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]汪天虹. 微生物分子育種原理與技術[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2005：288.

[2]高克祥，王淑紅，劉曉光，等. 木霉菌株T88對7種病原真菌的拮抗作用[J]. 河北林果研究，1999，14（2）：159-162.

[3]郭江洪，文成敬. 木霉和綠粘帚霉對柑桔青霉病菌的拮抗作用[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2001，14（3）：59-62.

[4]Zimand G，Elad Y，Chet I. Effect of Trichoderma harzianum on Botrytis cinerea athogenicity[J]. Phytopathology，1996，86：1255-1260.

[5]紀明山，李博強，陳捷，等. 綠色木霉TR-8菌株對尖鐮孢的拮抗機制[J]. 中國生物防治，2005，21（2）：104-108.

[6]史鳳玉，朱英波，楊文蘭. 長枝木霉T8對水稻紋枯病菌拮抗的作用研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2005，21（2）：264-265，271.

[7]Howell C R. Cotton seedling preemergence damping-off incited by Rhizopus oryzae and Pythium spp. and its biological control with Trichoderma spp.[J]. Phytopathology，2002，92（2）：177-180.

[8]Elad Y. Mechanisms involved in the biological control of Botrytis cinerea incited diseases[J]. Eur J Plant Pathol 1996，102：719-732.

[9]朱虹，汪章勛，樊美珍，等. 草莓灰霉病拮抗木霉菌株篩選及溫室防效測定[J]. 中國生物防治，2005，21（1）：52-54.

潘曉曦，關一鳴，張舒娜，等. 中藥提取物對人參灰霉病的防治效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：124-126.