梔子全國生產區劃中指標成分多波長HPLC方法建立

苗琦等

摘要：以梔子為研究對象，建立了多波長高效液相色譜法對梔子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ等 6種有效成分的測定方法，并將此方法應用于不同產地梔子成分含量的測定，為梔子全國生產區劃提供了可靠指標。

關鍵詞：HPLC；梔子；生產區劃

中圖分類號： O657.7+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0300-03

收稿日期：2014-09-17

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2011BAI04B01）；中央本級重大增減支項目（編號：20603020110、20603020213）；江西中醫藥大學校級研究生創新專項（編號：JZYC14C09）。

作者簡介：苗琦（1989—），男，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事中藥資源開發與應用研究。E-mail：miaoqi6213963@126.com。

通信作者：羅光明，博士，教授，主要從事中藥資源開發與應用研究。Tel：（0791）7118982；E-mail：jzlgm11@163.com。梔子是茜草科常綠灌木植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效。梔子主要生長在長江以南各省，主產于江西省、湖南省、湖北省、浙江省等地，是江西省道地藥材，也是市場上廣泛銷售的大宗藥材。中藥區劃研究中藥資源及其地域系統的空間分異規律，對特定環境下藥材的適生性進行評價，并以適當的方式表示出來，它是選擇中藥材引種栽培適生地的基本依據[1-2]。不同地區間中藥資源的差異性是中藥區劃的前提。中藥區劃研究中通常選取有效成分含量等可以定量化的要素作為區劃指標[1]。2010年版《中國藥典》中只對中藥梔子中的梔子苷這一有效成分進行了明確規定，但中藥成分的復雜性決定了單一成分或指標難以客觀評價中藥質量，只將梔子苷單一成分含量作為梔子藥材的區劃指標是無法對梔子進行生產區劃的。梔子苷并不能代表梔子藥材的所有藥效，梔子中主要含有環烯醚萜苷類、西紅花苷類、有機酸等化合物，主要有效成分包括京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。其中梔子苷具有抗炎、解熱、利膽、輕瀉的作用；京尼平苷酸具有抗腫瘤、抗氧化的作用；京尼平1-β-D龍膽二糖苷能改善戊巴比妥鈉引起的心力衰竭；綠原酸具有顯著的抗癌及保肝利膽作用；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ是西紅花和梔子中共有的色素類成分，具有去黃疸、利膽及明顯的降血脂作用[3]。本研究以梔子為對象，建立了多波長高效液相色譜法測定對梔子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ 等6種有效成分的方法，旨在為梔子區劃提供更加合理可靠的指標。1材料與方法

1.1儀器

Waters高效液相色譜儀，Empower工作站（美國Waters公司），BP224S電子天平（萬分之一）（北京賽多利斯儀器系統有限公司），KQ-300E超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2材料

甲醇色譜純（美國天地有限公司）；乙腈色譜純（美國ACS公司）；甲醇分析純（西隴化工股份有限公司）；娃哈哈純凈水；標準品：京尼平苷酸（111828-201102，純度按 96.0%計算）、綠原酸（110753-201314，純度按96.6%計算）、梔子苷（110749-201316，純度按97.5%計算）、西紅花苷-Ⅰ（111588-201202，純度按91.1%計算）、西紅花苷-Ⅱ（111589-201304，純度按92.4%計算）購于中國藥品生物制品檢定所，京尼平1-β-D龍膽二糖苷（批號為ZM0501BA14，純度>98.0%）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1供試品溶液的制備稱取0.1 g梔子粉末（過4號篩）置具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾。量取續濾液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻即得。

1.3.2對照溶液的制備稱定適量各對照品，分別置于 50 mL 棕色容量瓶中，用適量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分別制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龍膽二糖苷201.292 μg/mL、綠原酸4.443 6 μg/mL、梔子苷311.61 μg/mL、西紅花苷-Ⅰ 175.276 4 μg/mL、西紅花苷-Ⅱ 17.371 2 μg/mL的對照品儲備液。

1.3.3色譜條件Durashell C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脫：0～18 min（8%～15% A）；18～25 min（15%～23% A）；25～40 min（23%～35% A）；40～50 min（35%～50% A）；檢測波長：238、330、440 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2結果與分析

2.1對照品溶液、供試品溶液多波長HPLC分析

分別得到238 nm（圖1）、330 nm（圖2）、440 nm（圖3）下對照品、樣品的HPLC色譜圖，與相應對照品色譜峰保留時間及紫外光譜圖進行比對，確認了6個色譜峰的歸屬。

由此可知，京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、梔子苷在238 nm處有最大吸收波長；綠原酸在330 nm處有最大吸收波長；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ在440 nm處有最大吸收波長。故將238、330、440 nm定為6種有效成分的檢測波長。

2.2線性關系考察

將“1.3.2”節的混合對照品儲備液，分別用75%甲醇稀釋2、4、8、16、32、64倍，按“1.3.3” 節的色譜條件測定，進樣10 μL，以進樣量10 μL中對照品質量（μg）為橫坐標，最佳檢測波長下的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見表1。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗取稀釋2倍的混合對照品溶液10 μL，在“1.3.3”節的色譜條件下，連續進樣5次，測定峰面積。梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為0.55%、0.50%、041%、0.48、0.49%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性試驗取稀釋2倍的混合對照品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣10 μL，測定峰面積，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅰ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.21%、1.33%、097%、174%、1.51%、1.82%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.3重復性試驗取同一批藥材，按“1.3.1”節的方法平行處理5份，同法制成供試品溶液，測定峰面積，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.36%、1.89%、0.59%、130%、0.77%、1.43%，表明此法重復性良好。

2.3.4加樣回收率試驗稱取已知含量的樣品，共5份，加入2 mL混合對照品溶液，按照“1.3.1”節的方法制備供試品溶液，按照“1.3.3”節的色譜條件，進樣10 μL，依次測定6種有效成分的峰面積并計算平均加樣回收率，平均回收率分別為99.32%、99.48%、99.19%、99.34%、99.51%、99.65%，表明此方法回收率較好。

2.3.5樣品的含量測定按“1.3.1”節的方法制備12個不同產地的梔子樣品，經0.45 μm有機濾頭過濾后進樣10 μL，按“1.3.3”節的色譜條件，根據標準曲線計算梔子中6種有效成分的含量，結果見表2。

3結論與討論

3.1提取方法的選擇

本研究采用了20、30、40、50、60 min提取時間下回流、超聲2種提取方法，綜合分離度、峰形、峰數目、峰面積、重復性等因素，結果表明，回流40 min與50、60 min提取效果幾乎無差異，回流40 min為最佳回流提取時間；超聲 40 min與超聲50、60 min提取效果也幾乎無差別，提示超聲40 min為最佳超聲提取時間；超聲40 min與回流40 min提取效果幾乎一致，但由于回流重復性較差，同法制備樣品RSD較超聲高出很多，而且超聲較回流操作方法簡單，故選擇超聲40 min為樣品的提取方法。

3.2流動相的選擇

試驗過程中嘗試了甲醇-水、乙腈-水等體系，比較了在水中加入磷酸或甲酸峰形、分離度的差別，在確定流動相后，嘗試了多個梯度洗脫方法，結果表明，乙腈分離效果較甲醇更好，而且隨著乙腈比例的增加，保留時間顯著縮短，但分離度有所下降；加入磷酸或者甲酸使溶劑體系呈弱酸性，能改善峰形、分離度，但磷酸、甲酸之間并無明顯差別。

3.3檢測波長的選擇

大多數研究人員采用254 nm或者其他單一波長作為梔子成分的檢測波長，由于中藥成分復雜，采取單一檢測波長會出現峰組成單一、峰面積普遍偏小以及特征峰數量少等情況，后續的梔子指紋圖譜相似度計算也無法客觀反映梔子藥材的成分。梔子中主要含有環烯醚萜苷類、有機酸類、西紅花苷等化合物。本試驗使用DAD檢測器對樣品進行190～500 nm 全波長掃描，并對各波長下的色譜進行分析。結果表明，3類化合物的最佳檢測波長分別是238、330、440 nm。中藥成分的復雜性決定了單一成分或指標難以客觀評價中藥質量，如果只選取單一波長進行檢測，可能造成峰面積信息丟失或殘缺，所以本試驗選擇238、330、440 nm作為檢測波長，各峰分離良好，特征峰明顯且峰形較好，3個波長圖譜最大可能地獲取了色譜組分信息。

3.4不同產地梔子中6種有效成分的含量

本研究表明，不同產地的梔子中均含有梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸，部分產地梔子中由于綠原酸含量極少無法檢出，不同產地梔子中各成分含量既有相似之處，也存在很大的差別。梔子苷含量最高，其次含量較高的是西紅花苷-Ⅰ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷等。各成分的含量范圍波動較大，這可能是由于不同地區的土壤、氣候、水分、礦物質分布情況、藥材采收期及藥材種源等都會對中藥材質量產生影響。各地不同的自然生態環境條件直接影響生物的種類、數量、形態結構、生理功能等，自然生態環境與中藥資源的質量、數量密切相關[4]。

參考文獻：

[1]張小波，郭蘭萍，周濤，等. 關于中藥區劃理論和區劃指標體系的探討[J]. 中國中藥雜志，2010，35（17）：2350-2354.

[2]郭蘭萍，黃璐琦，蔣有緒，等. 2種不同模式中藥適宜性區劃的比較研究[J]. 中國中藥雜志，2008，33（6）：718-721.

[3]孟祥樂，李紅偉，李顏，等. 梔子化學成分及其藥理作用研究進展[J]. 中國新藥雜志，2011，20（11）：959-967.

[4]徐燕，曹進，王義明，等. 多波長高效液相色譜法同時測定梔子中的三類成分[J]. 藥學學報，2003，38（7）：543-546.李敏，王自健，路喆，等. 不同產地薰衣草H-701精油理化性質比較[J]. 江蘇農業科學，2015，43（2）：303-306.