青海省部分地區人工種植燕麥青貯乳酸菌的篩選

摘要：以青海高寒地區分布范圍廣、種植面積大、飼用價值較高的燕麥為對象，對其附著乳酸菌進行分離、鑒定，發現適合青海地區人工種植燕麥青貯的乳酸菌包括B74（植物乳桿菌）、B101（植物乳桿菌）、GC10（植物乳桿菌）、R2（干酪乳桿菌）、HT4（片球菌）、PP（片球菌）、D1404（糞產球菌或戊糖片球菌）。

關鍵詞：青海??；高寒地區；燕麥；青貯乳酸菌；篩選；菌落形態；菌株類型；青貯試驗

中圖分類號： S816.5+3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0205-04

收稿日期：2014-04-09

基金項目：青海省科技廳項目（編號：2010-N-516）。

作者簡介：徐婷（1986—），女，湖北孝感人，碩士研究生，從事反芻動物營養研究。E-mail：xutinghubei@163.com。

通信作者：劉書杰，研究員，碩士生導師，從事反芻動物營養研究。E-mail：mkylshj@126.com。青海省是我國五大牧區之一，牧草的需求量非常大[1]。近年來，燕麥開始在牧區大量種植，已成為高寒牧區枯草季節的重要飼草來源。人工種草制作青貯飼料，是解決高寒草地畜牧業冬春季節飼草料嚴重不足的有效措施之一[2]。乳酸菌在飼料工業中，尤其在青貯飼料的制備領域中有重要的作用[3-7]。青海高寒牧區的極端氣候環境使得傳統商品化乳酸菌在該地區的應用受到了限制，很難調制出品質良好的青貯飼料。因此，發掘和利用高寒地區鄉土產乳酸菌種質資源，對于在該地區制作青貯飼料具有重要的實踐意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料青海省貴南草業有限股份公司種植的青燕3號燕麥及表層土樣，采集于青海省貴南縣過馬營鎮，海拔約3 300 m；青海海北州高原現代生態畜牧業科技試驗示范園種植的加拿大燕麥及表層土洋，采集于青海省海晏縣，海拔約 3 200 m。

1.1.2儀器恒溫培養箱、超凈工作臺、超低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、振動器、pH計、天平、光學顯微鏡、PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、液相色譜儀，紫外分光光度計。

1.1.3試劑MRS培養基（參考中國科學院微生物研究所的配方）：酵母粉15 g/L，葡萄糖60 g/L，酪蛋白胨30 g/L，檸檬酸氫二胺6 g/L，乙酸鈉15 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，MnSO4 0.75 g/L，吐溫-80 3 mL/L，K2HPO4 6.0 g/L，牛肉膏 30 g/L，瓊脂15 g/L。113 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌，每平皿約20 mL。

MC培養基（參考中國科學院微生物研究所的配方）：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，瓊脂15 g/L。121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌，每平皿約20 mL。

鏡檢（采用G+染色）：草酸銨結晶紫，碘液，番紅。

凝膠電泳：瓊脂糖，TBE緩沖液，StarSpin細菌基因組DNA提取試劑盒，陽性對照菌種為大腸桿菌。

1.2試驗方法

1.2.1樣品制備取自然發酵的青貯飼料500 g左右密封保存，于4 ℃保存備用。

1.2.2青貯飼料中菌群結構分析試驗分為4組：第Ⅰ組編號GC（貴南燕麥青草樣）、第Ⅱ組編號GT（貴南燕麥地表層土樣）、第Ⅲ組編號HY（海晏燕麥青草樣）、第Ⅳ組編號HT（海晏燕麥地表層土樣）。取乳熟期整株燕麥減碎至1～2 cm，混勻稱重，土捏碎稱取3 g，加10倍的已滅菌的生理鹽水浸泡2 h，使表層含有的菌游離于生理鹽水中，整個過程在無菌室中進行。

將浸泡草樣及土樣的液體置于振蕩器上振蕩使菌均勻分布，分別取菌液作梯度稀釋液：10-1～10-5。取稀釋液在MRS培養基（添加制霉菌素50 mg/mL以抑制霉菌和酵母菌的生長）平板上涂布，每個稀釋梯度取200 mL涂布3皿，涂布完成后置于37 ℃溫箱中培養48 h。

1.2.3菌落形態特征觀察平板計數后，根據公式計算燕麥附著乳酸菌的活菌數（CFU/g）：活菌數=（同一稀釋度的重復平板上菌落平均數×稀釋倍數）/含菌樣品質量。計數后進行菌落形態觀察，并描述各菌株的菌落形態特征。

1.2.4細菌革蘭氏染色觀察挑取典型菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢，挑取培養48～72 h的菌落涂片，進行革蘭氏染色，100倍油鏡觀察。

革蘭氏染色法：取10 μL水于載玻片中央，再用接種環挑取少量菌落與載玻片上的水滴均勻混合并涂成薄的菌膜自然干燥，玻片向上在乙醇燈上快速烤干，結晶紫初染1 min后用水充分淋洗，滴加碘液媒染1～2 min水洗，用水充分淋洗后用吸水紙吸干水分，用95%乙醇脫色20 s并水洗，番紅復染 1～2 min 水洗，自然干燥100倍油鏡觀察。藍紫色為革蘭氏陽性菌，紅色為革蘭氏陰性菌。

1.2.5乳酸菌的分離和純化根據菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等挑取有透明圈的單菌落，進行革蘭氏染色、油鏡鏡檢，凡是疑似為乳酸菌并以劃線的方式在MRS培養基上繼續分離純化培養2次。如果鏡檢發現不純，就繼續劃線純化，直至純化為止。將純化后的菌株接種到MRS液體培養基上培養，再將菌液接種到保存液（含60%甘油，體積為1 ∶1）中，并在-80 ℃條件下保存備用。

1.2.6乳酸菌的初步篩選將鑒定過的乳酸菌分別按3%的接種量轉入MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養，每隔2 h測定不同菌株發酵液pH值，繪制的產酸速率曲線即不同發酵時間（h）所對應發酵液pH值的變化曲線，根據不同菌株的產酸能力以及產酸速率來篩選適宜的用作青貯飼料的菌株。用待測菌株培養24 h的培養液，以3%的接種量接入MRS液體培養中，于37 ℃培養箱中培養48 h，以培養基為空白，在620 nm下測定樣品的吸光度。endprint

1.2.7優良乳酸菌的菌種鑒定優良乳酸菌的菌種鑒定采用16S rRNA序列測定，即分離的乳酸菌在MRS培養基中培養8 h后進一步純化并進行菌株DNA的提取，DNA提取試劑盒由天根生化試劑（北京）有限公司提供，DNA提取及純化按照試劑盒使用方法進行。

2結果與分析

2.1分離菌株菌落形態及菌體細胞形態觀察

由表1可以看出，所篩菌種大多為中等大小、中間凸起、表面光滑的白色菌落。

2.2乳酸菌的初步篩選

從pH值下降快、生長速度快指標進行篩選，初篩出菌號為R2、R6、HC58、HC64、HT4、 HT2、GC10、GC21、 GC26、 GC44、B29、 B74、 B90、 B101的菌（表2）。

2.3細菌革蘭氏染色觀察

圖1顯示，所選菌大多為桿菌，1個或成對出現。

2.4優良乳酸菌的篩選

將pH值下降快、生長速度快的菌株進行實驗室小規模模擬青貯試驗，其pH值測定結果見表3，其中編號為R2、HT4、GC10、GC44、B101、D1404、YX的pH值下降快且穩定，可用于袋貯青貯試驗。

2.5青貯菌種鑒定結果

篩選出的優勢菌種經測序后冷凍干燥制成菌劑，并測定其活菌數，篩選出的菌種情況見表4。

3結論與展望

以青海高寒地區分布范圍廣、種植面積大、飼用價值較高的燕麥為原料，對其附著乳酸菌進行分離、鑒定，發現適合青海地區人工種燕麥青貯的乳酸菌包括B74（植物乳桿菌）、B101（植物乳桿菌）、GC10（植物乳桿菌）、R2（干酪乳桿菌）、HT4（片球菌）、PP（片球菌）、D1404（糞產球菌或戊糖片球菌）。

畜牧業是青海的支柱產業，但是目前青海草場退化、草畜不平衡、自然災害頻發，一直制約著青海畜牧業發展，而青貯飼料是解決青海牧區飼草不平衡的有效措施之一。目前，我國對青貯飼料的調制主要利用國外商業化的乳酸菌制劑，但是在青海高寒地區燕麥收獲季節的氣溫大概在15 ℃左右，低菌株編號菌株類型活菌數（CFU/g）B74植物乳桿菌4.31×1011B101植物乳桿菌1.49×108GC10植物乳桿菌6.40×1010R2干酪乳桿菌6.41×1011HT4片球菌3.73×1011PP片球菌1.07×1011D1404糞產球菌或戊糖片球菌1.00×108YX商品混合菌（臺灣亞芯）1.00×108

參考文獻：

[1]尚拜. 青海省草地資源概況[J]. 養殖與飼料，2010（11）：93-95.

[2]李夢寒. 藏東南乳酸菌青貯添加劑的研究與應用[D]. 拉薩：西藏大學，2009.

[3]Gordon F J. Improving the feeding value of silage through biological control[C]//Proceedings of the All-tech European Lecture Tour，1992：2-17.

[4]Cai Y，Ohmomo S，Kumai S. Distribution and lactate fermentation characteristics of lactic acid bacteria on forage crops and grasses[J]. J Grassl Science，1994，39：420-428.

[5]Cai Y，Ohmomo S，Ogawa M，et al. Effect of NaCl-tolerant lactic acid bacteria and NaCl on the fermentation characteristics and aerobic stability of silage[J]. Journal of Applied Microbiology，1997，83（3）：307-313.

[6]Sanderson M A. Aerobic stability and in vitro fiber digestibility of microbially inoculated corn and sorghum silages[J]. J Anim Science，1993，71：505-514.

[7]Weinberg Z G，Ashbell G，Hen Y，et al. The effect of applying lactic acid bacteria at ensiling on the aerobic stability of silages[J]. J Appl Bacteriol，1993，75：512-518.

[8]張琳，德科加. 青藏高原特種青貯牧草的品質評定試驗[J]. 青海畜牧獸醫雜志，2007，37（1）：15-16.孫鵬飛，崔占鴻，拜彬強，等. 高原放牧牦牛夏初補飼精料對體質量的影響[J]. 江蘇農業科學，2015，43（2）：209-212.endprint