羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株遺傳背景的RAPD分析

摘要：為了給無籽羅漢果優良品種的選育提供分子生物學依據，利用RAPD標記對28份羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株進行遺傳背景分析。結果表明，羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景存在一定的豐富性，但大多遺傳相似性系數較大，遺傳距離較近。總的來說，羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株遺傳背景的復雜性較低，應該盡快采取相應措施，進行種質創新，豐富無籽羅漢果親本的遺傳背景。

關鍵詞：羅漢果；二倍體；三倍體；遺傳背景；RAPD

中圖分類號： S567.903文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0241-03

收稿日期：2014-04-15

基金項目：國家科技支撐計劃 （編號：2011BAI01B03）；國家自然科學基金 （編號：81373914）；廣西自然科學基金（編號：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）

作者簡介：韋榮昌（1983—），男，廣西梧州人，博士，助理研究員，主要從事生藥學研究。E-mail：wrc830612@163.com。羅漢果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄異株的葫蘆科（Cucurbitaceae）羅漢果屬多年生藤本植物[1]，為我國南方特有的珍貴藥用植物和甜料植物，主產于廣西壯自治區永福、臨桂、龍勝、興安和融安等地[2]。羅漢果果實含多種甜苷，其中甜苷V為世界上最強的非糖甜味物質之一，為蔗糖甜度的300～400倍，是一種綜合性狀極佳的天然甜味劑，廣泛應用于食品、藥品和保健品中，適合所有人群長期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血壓患者的理想糖替代品[3-4]。多倍體羅漢果可大幅提高根、莖、葉、果實等部位的生物量和產量，其中三倍體羅漢果還具有無籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，對整個羅漢果產業具有里程碑的意義[5]。羅漢果三倍體雌株經二倍體雄株授粉后所結的果實即為無籽羅漢果。本研究利用RAPD分子標記技術[6-9]探討羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景，為無籽羅漢果優良品種的選育提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料采自廣西桂林興安縣漠川鄉的羅漢果種植基地，總共采集到28份材料：二倍體雄株7份，三倍體雌株21份，利用二倍體（或四倍體）父本花粉對四倍體（或二倍體）母本柱頭進行人工授粉雜交獲得（表1）。每份材料選取生長狀況良好的羅漢果單株3～5株，采集約10張健康成熟的葉片并混合成該份材料的樣品，用硅膠干燥保存，帶回實驗室中待用。

1.2RAPD分析

采用改良CTAB（2×）法[10]提取羅漢果葉片的總DNA。

引物篩選：從材料中隨機選出6份樣品（包含2x、4x）進行引物篩選，從200條RAPD引物中篩選出20條擴增反應穩定、條帶清晰、具有多態性的引物，并用于所有材料的擴增。20個RAPD引物名稱、序列見表2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物：將擴增產物置于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠上所加電壓不超過5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作為標準分子量對照，經溴化乙錠（EB）染色20～30 min，在凝膠成像系統上觀察拍照、記錄。

RAPD為顯性標記，同一引物的擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，相同遷移位置上有擴增條帶記錄為1，無擴增條帶記錄為0，構建0-1原始矩陣。僅清晰、穩定、可分辨的并且長度在400～2 000 bp范圍內的ISSR擴增條帶才被記錄。用AFLP-SURV version 1.0[12]計算材料間遺傳距離D，按D=-lnⅠ計算Nei & Li遺傳相似性系數；用NTSYS-pc version 2.02[13]軟件的UPGMA（unweighted pair group method using arithmatic average）方法進行聚類分析；用GenAIEx version 6.3[14]進行主坐標分析。

2結果與分析

2.1多態性分析

用20個RAPD引物對28份材料的總DNA進行PCR擴增，重復2次，2次擴增產物重復性好且穩定，擴增得到的總條帶數及多態性條帶數見表2。20個引物擴增條帶數的范圍為 6～17條，共同帶在1～8條內，多態性條帶數范圍為3～13條，多態性百分比為25.00%～88.89%，且由總計的結果可知，擴增總條帶數為239條（平均每個引物11.95條），其中最多，為17條；引物S170得到的條帶最少，為6條。其中，引物S411的擴增圖譜見圖1。此外，在不同羅漢果品種間存在的多態性條帶可作為鑒定品種的特征帶。

2.2遺傳相似性系數及遺傳距離

28份材料間的相似性系數變化范圍為0.691 0～0.920 6，其中F302與M202間的相似性系數最低（0.691 0），遺傳距離最高（0.369 6）；而F305與F306間的相似性系數最高（0.920 6），遺傳距離最小（0.082 7）。

2.3聚類分析

從圖2可看出，F305和F306直接聚為一類，具有很高的相似性系數，兩者距離最近；F321獨成一支，與其余材料相距較遠；基本上相似性系數較高的材料排列并聚為一類。

2.4雙變量主坐標分析

主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于Nei & Li遺傳距離及相應的相似性系數進行的。因此，主坐標分析圖中各個個體（品種）間的位置關系反映了它們在遺傳上的相似性。由于每份試驗材料都是通過選取生長狀況良好的羅漢果單株3～5株，共采集約10張健康成熟葉片混合而成的，因此這28份材料的主坐標分析可看作“雙變量主坐標分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：一種將物種與物種之間差異考慮到群體間相互關系的測度之中的排序方法）[15-16]。通過RAPD標記對28份材料進行DPCoA排序發現，前3個主坐標的方差貢獻率分別為26.81%、21.86%endprint

和17.60%，相對應的累積貢獻率分別為26.81%、48.67%和66.27%。一般認為，如果前3個主要特征向量的方差占總方差的40%以上，則排序效果是滿意的[17]，本試驗結果 28 份材料的前3個主要特征向量的方差累積貢獻率高達6627%，說明降維效果較好。因此，保留DPCoA的前二軸對28份材料進行排序分析，應用GenAIEx version 6.3獲取坐標軸特征值及樣品特征向量，并據此劃分出28份不同材料在DPCoA前二軸空間中的排序圖見圖3。

由Proj劃分而得的28份材料在PCoA排序圖中空間分布十分明顯，除F316和F318有部分交叉重疊外，其余樣品間均無交叉重疊現象。PCoA排序圖把28份材料分為三大類。第一大類位于A區間，其中三倍體雌株4份（F312、F313、F320、F321），二倍體雄株2份（M201、M204）。第二大類位于B和第D區間，其中只包括三倍體雌株12份（F301、F302、F303、F304、F305、F306、F307、F308、F309、F310、F311、F314）。第三大類位于C區間，其中只包括三倍體雄株3份（F316、F318、F319）、二倍體雄株5份（M202、M203 、M205、M206 M207）。

比較圖2和圖3可知，對28份材料所進行的親緣關系聚類分析和雙變量主坐標分析的結果基本上是一致的，雌株和雄株間的距離相對較近聚在一起，而雙變量主坐標分析能從多個方向、多個層面更直觀和準確地反映材料間的遺傳關系。

3結論與討論

3.1羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株的RAPD相關遺傳

根據RAPD分析結果可知，有的材料之間雖然是不同的種質，但遺傳相似性系數較高，說明它們的親緣關系近；如F315因為由Nongyuan B6與M204株系雜交而成，所以與M204關系較近，其相似性系數高達0.816 3。此外，在三倍體雌株中，如果其親本相同或相似性系數較高，由于子代繼承了親本一定的遺傳物質，因而子代間的相似性系數也會較高，如F318和F319，由于其母本都是Yongqing 1，因此其相似性系數高達0.912 3；而因為F305和F310也都為同一父本M205，所以其相似性系數也高達0.858 0。

3.2羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株的合理組配

F302與M202間的相似性系數僅為0.6910，還有M201與F302、F309及F312與M207間的相似性系數都僅為0.716 1，遺傳距離較大；而且M202與母本間的相似性系數均在 0.6～0.7 之間。因此，初步推測羅漢果三倍體雌株與二倍體雄株中最適合作雌雄組配的是F302與M202，其次是F302與M204、F309與M204、F312與M207。

值得指出的是，雖然羅漢果三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景存在一定的復雜性，但大多遺傳相似性系數較大，遺傳距離較近，應該盡快采取相應措施，進行種質創新，豐富三倍體雌株和二倍體雄株的遺傳背景，為無籽羅漢果優良品種的選育奠定堅實基礎。endprint