耐鎘菌株的篩選及生物學特性

許欽坤　趙翠燕

摘要：從污染土壤中，分離出1株能高度抗鎘和吸附鎘的菌株S-1，經(jīng)初步鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。對其生物學特性進行研究，結果表明，該菌株在液體細菌培養(yǎng)基中耐鎘（Cd）濃度高達600 mg/L；菌株S-1對Cd2+有較好的吸附效果，吸附率高達75.4%。

關鍵詞：篩選；耐鎘菌株；生物學特性

中圖分類號： X131.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0317-02

收稿日期：2014-04-02

基金項目：廣東省科技計劃（編號：2011B010500018）；廣東省韶關市科技計劃（編號：313-140513）。

作者簡介：許欽坤（1977—），男，山東單縣人，碩士，講師，主要從事資源微生物利用研究。

通信作者：趙翠燕。E-mail：bethzhao2003@163.com。鎘（Cd）是嚴重危害人類健康的重金屬元素，極微量就會對人體造成危害，鎘進入人體后，可對腎臟、骨骼、肺部、心血管等器官造成危害。許多農(nóng)村、城市的土壤和水資源受到不同程度的鎘污染，用受污染的水灌溉時，可使灌區(qū)和下游地區(qū)的農(nóng)作物受鎘污染，并富集于農(nóng)作物中，從而進一步危害人體健康。另外，自然環(huán)境一旦被鎘污染，消除其影響是很困難的。生物修復技術是重金屬污染土壤治理的重要手段之一，具有處理費用低、對環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點，目前，利用微生物進行重金屬污染土壤的修復是近幾年國內(nèi)外研究的熱點。微生物是通過代謝活動及其產(chǎn)物來促進重金屬的溶解，從而提高重金屬在土壤中的生物有效性[1]，微生物還能促進植物旺盛生長，增大植物生物量，通過強化植物來修復重金屬污染土壤。本研究從鎘污染土壤中分離耐鎘細菌，對其進行初步研究，以期為該細菌在鎘污染治理中的應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品采自廣東某鉛鋅礦區(qū)周圍土壤。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、NaCl 3 g、瓊脂粉12.0 g、水600 mL，pH值為7.0～7.2；液體培養(yǎng)基：不加瓊脂的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基：在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，加人不同濃度的Cd2+溶液。硝酸鎘、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑，化學純，均為國產(chǎn)；細菌基因組DNA小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒等，均購于大連寶生物工程有限公司；Goldview，購于廣州瑞真公司。

1.1.3主要儀器手提式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)；MAKE KA-1000型低速離心機，海安亭科學儀器廠生產(chǎn)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市晶玻實驗儀器廠生產(chǎn)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的培養(yǎng)及分離純化試驗選用稀釋平板法[2]，在無菌條件下，將一定量的土樣放入一定體積的無菌水中，用移液管反復吹洗，直至顆粒狀樣品打散，搖勻，分別配制10-2、10-3、10-4、10-5菌懸液；分別吸取0.1 mL菌液，置于含有40 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)，涂布均勻，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待長出菌落后，挑取光滑透明、濕潤的單菌落劃線分離，在37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，獲得其純培養(yǎng)；進一步轉接到含有100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，選用長勢較好的菌作斜面，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2菌株常規(guī)生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]，對菌株進行系列生理生化特性試驗，主要包括甲基紅試驗、乙酰甲基醇試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗及吲哚試驗等，每組2個平行。

1.2.3耐鎘菌株16S rRNA 基因序列分析將篩選到的菌株接種到培養(yǎng)基平板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取單菌落到液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)過夜；用細菌基因組DNA小量提取試劑盒提取總DNA為模板，進行16S rRNA 基因PCR 擴增，所用引物為27 F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′[4]。PCR總反應體系為：10×buffer 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 1 μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取 5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由上海生工公司測序；將16S rDNA的測序結果輸入基因庫（GenBank）進行序列比對。

1.2.4菌株對鎘的耐受性配制含Cd2+濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700、800 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液；將斜面保存的菌株在無鎘液體培養(yǎng)基中活化24 h，以2%接種量接入培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。

1.2.5菌株對鎘的吸收性能將斜面保存的菌株轉接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h；吸取菌液 0.5 mL 接入50 mL滅菌、含Cd2+100 mg/L的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，以不加菌株、直接加入0.5 mL無菌水為對照培養(yǎng)基，于37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h；細菌懸浮液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，取其上清液；用原子吸收儀測定上清液中鎘的濃度，計算菌株對培養(yǎng)液中有效鎘的吸附率：吸附率=（C0-C1）/C0×100%，式中，C0為對照的鎘濃度（mg/L ），C1為吸附后上清液的鎘濃度（mg/L）[5]。試驗重復3 次。

2結果與分析endprint

2.1耐鎘菌株的篩選

從含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基中分離得到1株耐鎘細菌，菌落乳白色，表面粗糙，不透明，經(jīng)革蘭氏染色呈陰性；菌體桿狀，命名為S-1。經(jīng)生理生化試驗分析，結果表明，菌株S-1甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉酶、過氧化氫酶、明膠液化試驗檢測均呈陽性，吲哚試驗檢測呈陰性。

利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度約為1 500 bp的擴增產(chǎn)物（圖1）。Blast比對分析顯示，菌株S-1與Bacillus cereus AF290547的16S rDNA 序列同源性高達97%，結合形態(tài)觀察和生理生化試驗結果，表明 S-1菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.2菌株對鎘的耐受性

菌株S-1在含Cd2+濃度范圍0～200 mg/L的液體培養(yǎng)基中生長良好；Cd2+濃度超過300 mg/L時，菌株S-1的生長受到抑制；當Cd2+濃度增加到超過700 mg/L時，菌株S-1的生長完全被抑制。這說明菌株S-1對Cd2+的最大耐受濃度為600 mg/L。

2.3菌株對鎘的吸收性能

菌株S-1在含Cd2+100 mg/L的培養(yǎng)基37 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，離心，收集上清液，過原子吸收儀測定上清液中Cd2+的濃度，結果表明，菌株S-1對Cd2+的吸附率為75.4%。

3結論

試驗篩選到1株耐鎘菌株S-1，經(jīng)生理生化試驗和16S rRNA序列分析，鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）；菌株S-1的Cd2+最大耐受濃度為600 mg/L，對Cd2+的吸附率為75.4%。菌株S-1對鎘具有較強的抗性和富集能力，在鎘污染治理中有良好的應用前景。

參考文獻：

[1]陳素華，孫鐵珩，周啟星，等. 微生物與重金屬間的相互作用及其應用研究[J]. 應用生態(tài)學報，2002，13（2）：239-242.

[2]中國科學院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M]. 北京：科學出版社，1978.

[3]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[4]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[5]王俊麗，任建國. 耐鎘微生物的篩選及其吸附能力研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（3）：499-502.姜曉龍，金磊磊，陳輝輝，等. 1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（2）：319-322.endprint