海南粗榧內生真菌抗腫瘤活性菌株篩選

蔣春潔等

摘要：利用鐮刀菌篩選模型和腫瘤細胞篩選模型對 190 株分離自海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis L.）的內生真菌進行了抗腫瘤活性篩選。結果顯示，16 株內生真菌的乙酸乙酯提取物對人慢性髓原白血病細胞K562、急性早幼粒白血病細胞NB4、人肝癌細胞HepG-2抑制率大于50%，具有細胞毒活性，其中菌株JFL3007a和BWL6045的乙酸乙酯提取物對人慢性髓原白血病細胞K562、急性早幼粒白血病細胞NB4、人肝癌細胞HepG-2均有較好的抑制作用。為進一步尋找其生物活性成分奠定了基礎。

關鍵詞：海南粗榧；內生真菌；鐮刀菌；抗腫瘤活性

中圖分類號： Q948.12+2.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0329-03

收稿日期：2014-04-04

基金項目：科技部中泰長期合作研究開發項目（編號：18-514J）；博士后科學基金 （編號：90279）；海南省自然科學基金 （編號：313034）。

作者簡介：蔣春潔（1989—），女，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mail：903586099@qq.com。

通信作者：李從發，教授，博士生導師。E-mail：congfa@vip.163.com。海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis L.），為三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉屬（Cephalotaxus）植物，別名紅殼松、薄葉蓖子杉，屬多年生高大常綠喬木，為國家二級重點保護植物。海南粗榧樹皮中含有5種在臨床上對急性非淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病等有顯著療效的酯堿：三尖杉堿（cephalotaxine）、三尖杉酯堿（harringtonine，HT）、高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）、異三尖杉酯堿（isoharringtonine）、去氧三尖杉酯堿（deoxyharringtonine）[1]。海南粗榧中這5種生物堿的含量是三尖杉屬植物中含量最高的，被認為是非常具有潛力的天然抗癌藥源[2]。

植物內生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部，而不使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物。因其長期生活在植物體細胞間隙這樣一個特殊環境中，并與寄主協同進化，形成穩定的生態關系，可能具備產生與宿主植物相同或相似的生物活性成分的能力。1993年Strierle等首次從短葉紅豆杉（Taxus breviflia）的樹皮中分離出能產生具有抗腫瘤活性紫杉醇（Taxol）的內生真菌，這為人類解決藥用植物生長緩慢，由于大量采伐引起資源緊缺和生態破壞等問題提供了新思路[3]。

近幾年來，從海南粗榧內生真菌次生代謝產物中分離到乙酰基細胞松弛素D、細胞松弛素D、環二肽、對羥基苯乙醇等抗腫瘤抗菌活性產物，以及一些新的化合物，初步揭示海南粗榧內生真菌代謝產物具有多樣性[4-6]。我們從海南3處不同地點采集的海南粗榧樹皮、枝和葉樣品中，分離得到 190 株內生真菌，利用鐮刀菌篩選模型和細胞模型對這些內生真菌的抗腫瘤和抗菌活性進行初步篩選，為進一步研究其活性成分奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1內生真菌190株海南粗榧內生真菌，由本實驗室從海南省熱帶植物園、海南省尖峰嶺自然保護區、海南省霸王嶺自然保護區的海南粗榧樹皮、樹枝、樹葉中分離，并保存。

1.1.2鐮刀菌模型菌株與腫瘤細胞株鐮刀菌（Fusarium oxysporum）C-4菌株，由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所提供；人慢性髓原白血病細胞K562，急性早幼粒白血病細胞NB4購于中國典型培養物保藏中心，人肝癌細胞HepG-2購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.3培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 （PDA）：200 g洗凈的土豆，切成小塊，加水煮至可以碾碎，分別用四層紗布，八層紗布和十六層紗布依次過濾，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，定容至1 000 mL，pH自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）：制作步驟同PDA培養基，不加瓊脂。 K562，NB4細胞用RPMI1640培養基，添加10%胎牛血清，HepG-2細胞用DMEM高糖培養基，添加10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1內生真菌發酵液樣品的制備將試管斜面保存的內生真菌經 PDA 培養基活化后，接種于 PDB 培養基中，26 ℃、160 r/min 培養10 d。真空抽濾，取發酵液，5 000 r/min 離心 30 min 后取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.2.2乙酸乙酯提取物樣品的制備將試管斜面保存的內生真菌經 PDA 培養基活化后，接種于PDB 培養基中，26 ℃、160 r/min 培養10 d，分離菌體，50 ℃減壓濃縮至20～30 mL，用等體積乙酸乙酯萃取3次，再減壓蒸干。用含DMSO（1%）的PBS溶液溶解提取物，終濃度為2 000 μg/mL，-20 ℃ 保存備用。

1.2.3鐮刀菌篩選模型[7]將鐮刀菌接種在PDA培養基上，28 ℃培養10 d，用無菌水洗下孢子，搖勻過濾，用PDB培養基稀釋成濃度為1 mL 1×104個的孢子懸液。于96孔板上每孔加入50 μL孢子懸液，再加入50 μL發酵液樣品，并設置空白對照，4個復孔；繼續培養16 h后，用倒置光學顯微鏡進行觀察，對比空白對照，根據鐮刀菌孢子或菌絲生長的形態異常現象，對樣品的活性程度進行等級劃分，分別表示為：生長抑制（×），高度變形（+++），中度變形（++），輕度變形（+），生長正常（—）。如圖1所示。

1.2.4最佳細胞鋪板濃度的確定[8-10]取對數生長期的人慢性髓原白血病細胞腫瘤細胞K562、急性早幼粒白血病細胞NB4（直接計數），人肝癌細胞HepG-2（用0.25%胰酶消化后，制成細胞懸浮液計數），接種于96孔培養板內，每孔細胞密度從低到高依次為：1×104、2×104、4×104、6×104、8×104、 1×105個/mL，各設6個復孔，37 ℃培養72 h后，加 5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，繼續反應4 h，再加入100 μL三聯液，放置過夜，使甲臜完全溶解，在570 nm條件下，用酶聯免疫檢測儀測量其D值。選擇D值與細胞濃度呈線性關系，且D值相對較大時的細胞濃度作為最佳細胞鋪板濃度。endprint

1.2.5腫瘤細胞篩選模型——MTT比色法[11]選取對數生長期腫瘤細胞，用相應的培養基制成細胞懸浮液，用自動細胞計數儀計數，按各細胞的最佳鋪板濃度接種 90 μL 于 96 孔細胞培養板，5% CO2，濕度 90%以上，37 ℃培養。24 h后加入樣品 10 μL，繼續培養 48 h，取出置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，然后加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，37 ℃ 反應 4 h 后，再向各孔加入 100 μL 三聯液（10%SDS，5%異丁醇，01%濃鹽酸），充分溶解，放置過夜。用酶聯免疫檢測儀測量各孔在570 nm的D值，按下式計算抑制率。

抑制率（IR）=（1-待測樣品D570值/空白對照D570值）×100%。

1.2.6活性菌株的形態鑒定將試管保藏的活性菌株接種于PDA平板上，待生長出菌絲后插片培養，將培養后帶有菌絲的插片用棉蘭染液染色，在光學顯微鏡下觀察其菌絲、孢子的形態并拍照。根據真菌菌落形態特征和顯微形態特征，參照魏景超先生的《真菌鑒定手冊》第二版，初步判定其種屬。

2結果與分析

2.1最佳細胞鋪板濃度的確定

培養72 h后，用酶聯免疫檢測儀測定K562、NB4、HepG-2細胞數量與吸光度D值的關系（圖2）。選擇D值與細胞濃度呈線性關系，且D值在0.8～1.2之間的細胞濃度作為最佳細胞鋪板濃度，由圖2可知，K562、NB4、HepG-2細胞的最佳鋪板濃度分別為4×104、 6×104、 6×104個/mL。

2.2海南粗榧內生真菌發酵產物的抗腫瘤活性

首先利用鐮刀菌篩選模型對海南粗榧內生真菌的發酵液樣品進行初篩，共獲得113個陽性樣品（活性程度至少為

“+”）。然后對挑選出的活性較好菌株發酵液用乙酸乙酯提取，利用MTT比色法進一步檢測陽性樣品對K562等細胞的抑制率。發現至少對1株腫瘤細胞抑制率大于50%的陽性樣品有16個（表1）。其中，對K562細胞抑制率在90%以上的內生真菌有9株，占內生真菌總數的4.7%。菌株JFL3007a和BWL6045的乙酸乙酯提取物對3種腫瘤細胞均有抑制作用，對K562、NB4和HepG-2細胞的抑制率分別達到99.15%、88.41%、63.92%和88.30%、84.37%、69.35%。因此，JFL3007a和BWL6045可以作為潛力菌株進行進一步研究。

2.3活性菌株的形態鑒定

菌株JFL3007a和菌株BWL6045在PDA平板上，28 ℃培養10 d后其菌落形態見圖3。JFL3007a菌落蔓延生長，平坦，正面灰白色，背面黃褐色，菌絲不易挑起；BWL6045菌落蔓延生長，菌落高度約為2～3 mm，正面白色，有部分區域呈黃色，背面也為白色，菌絲呈棉絮狀，易挑起。

由兩株菌的顯微照片（圖4）顯示，兩者的菌絲與孢子形態均相似，菌絲有隔，未發現孢子囊，分生孢子單細胞，細小，呈橢圓形或卵形。根據《真菌鑒定手冊》[12]初步判定其為半知菌亞門，腔孢綱，球殼孢目中的擬莖點霉屬（Phomopsis）。

3討論

稻瘟霉篩選模型是利用微管機能抑制活性原理篩選抗腫瘤藥物，因屬于真核細胞，與人體細胞具有相似的生理基礎，其微管和微管蛋白結構也相似，是近年來篩選抗腫瘤活性物質的重要模型之一[13-14]。鮑時翔等[7]在篩選抗鐮刀菌抗生素時發現鐮刀菌Fusarium oxysporum T-6也可應用于抗腫瘤活性物質的篩選，因此建立了鐮刀菌篩選模型，將該模型與腫瘤細胞篩選模型組合，成功篩選到了12株具有較好抗腫瘤活性的海洋微生物。考慮到鐮刀菌篩選模型具有實驗周期短、樣品處理量大、所需費用低等優點，我們利用它對分離得到的190株海南粗榧內生真菌進行初篩，再用細胞模型復篩，篩選到16株具有抗腫瘤活性的內生真菌。其中對3株腫瘤細胞均具有較好活性的菌株JFL3007a和BWL6045經形態學鑒定，均為擬莖點霉屬。擬莖點霉屬真菌是重要的植物病原菌，主要對被子植物和裸子植物有害，在熱帶、亞熱帶地區種類多[15]。擬莖點霉屬也是一種植物內生真菌，在自然界的大部分植物體內廣泛存在。勞佳萍[16]以各種藥用植物為研究對象，分離鑒定出擬莖點霉屬內生真菌，并證實無論是病原擬莖點霉菌，還是共生擬莖點霉菌都不是寄主專化性。但目前對于植物內生真菌擬莖點霉菌的次級代謝產物中是否含有與宿主植物相同或相似的活性物質，未見報道；在海南粗榧內生真菌的研究方面，未見有發現擬莖點霉屬的報道。因此，對這兩株菌的分子生物學鑒定與代謝產物的抗腫瘤活性需進一步研究。

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