2013-2014年我國東北地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和NSP2基因遺傳變異分析

常曉博，葉超，趙款，姜成剛，王淑杰，蔡雪輝，張輝，安同慶*

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001)

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2013-2014年我國東北地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和NSP2基因遺傳變異分析

常曉博1,2，葉超2，趙款2，姜成剛2，王淑杰2，蔡雪輝2，張輝1*，安同慶2*

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130118；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001)

為了解2013-2014年我國東北地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的遺傳變異情況，研究對東北地區3個省份29個地區采集的123份樣品進行了檢測，并對20份陽性樣品的GP5和部分NSP2基因進行了RT-PCR擴增、測序、遺傳進化及序列比對分析。結果表明：我國東北地區PRRSV陽性率為16%，與國內外已發表的10株PRRSV參考株相比，GP5基因的核苷酸同源性為84.4%～100%。GP5氨基酸序列分析表明，大多數毒株在氨基酸高變區、中和表位和誘導表位發生了變異，主要變異為：C24→Y24，F25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34。LN283株GP5和NSP2基因遺傳進化樹的不同結果表明，LN283株可能涉及PRRSV基因重組。HLJ13株NSP2基因PCR擴增產物有2條相差90 bp的目的條帶，且NSP2基因遺傳進化樹顯示兩條序列分別屬于CH-1a亞群和HuN4亞群，推斷HLJ13株可能為經典和高致病性混合感染株。GP5和NSP2遺傳進化及氨基酸序列分析結果表明，所有病毒株均屬于北美洲型，且以HP-PRRSV為主，經典株與變異株共存。本研究結果可為我國東北地區PRRSV遺傳進化研究及疫病防控提供參考。

PRRSV；GP5；NSP2；遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一種廣泛流行且嚴重影響養豬業健康發展的以繁殖障礙和呼吸道癥狀為特征的傳染病[1-2]，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus, PRRSV)。根據抗原性差異，PRRSV可分為兩個血清型：基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。目前該病在世界各主要養豬國家均有發生，我國主要流行株為基因Ⅱ型，即北美洲型[4]。

PRRSV在自然界和免疫壓力下極易發生變異和基因重組，其毒力由多基因控制，并且存在于病毒的結構蛋白和非結構蛋白中。PRRSV基因組中，ORF5是高變區之一，其編碼的GP5蛋白是最主要的保護性抗原蛋白[5]，并且具有受體識別作用和誘導細胞凋亡的功能[6]。PRRSV編碼的非結構蛋白中，NSP2最易發生變異和缺失。歐洲型和北美洲型NSP2高變區氨基酸缺失的報道[7]表明NSP2對于病毒的復制不具有決定性作用但在宿主免疫方面可能具有至關重要的作用。Kappes等[8]通過免疫電子顯微技術觀察到NSP2與PRRSV的病毒粒子相關；通過蛋白質印跡分析得到NSP2以多種亞型參與了病毒粒子的構成。在PRRSV基因組中GP5和NSP2基因是最易發生變異的，因此針對GP5和NSP2基因變異的研究可以在一定程度上反應PRRSV整個基因組的變異情況。

本研究對東北地區3個省份29個地區的123株PRRSV進行PT-PCR檢測，并對20株陽性樣品GP5和NSP2基因進行了遺傳進化及序列分析，從而了解2013-2014年東北地區PRRSV的遺傳變異情況，為東北PRRSV的防制及分子流行情況提供一定的實驗數據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 來源于我國東北地區3個省份29個地區中小型規模化豬場送檢的豬的肺臟、淋巴結、腎臟和脾臟。

1.1.2主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit購自QIAGEN公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV、Recombinant RNase Inhibitor、TaKaRa EX Taq Hot Start Version、pMD18-T Vector Kit、E.coliDH5a感受態均購自寶生物工程(TaKaRa)有限公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中已登錄的國內外經典PRRSV毒株NSP2和GP5序列的保守區，以HuN4(GenBank no. EF635006)為模板，設計并合成了擴增部分NSP2基因和完整GP5基因的特異性引物(表1)。

表1 NSP2和GP5的擴增引物

1.2.2 病料處理與RT-PCR鑒定 取豬的肺臟、脾臟和淋巴結等組織剪碎、研磨、制成勻漿，反復凍融3次，以8000 r/min離心3 min，取200 uL上清液按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒RNA，然后按照EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix操作說明對所檢病料進行PRRSV鑒定。

1.2.3 PRRSV陽性樣品GP5和NSP2基因的擴增與測序 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作手冊提取PRRSV陽性樣品總RNA，反轉錄成cDNA后用于全長GP5和部分NSP2基因的擴增。利用膠回收試劑盒回收PCR擴增產物并與pMD18-T載體16 ℃過夜連接，轉化并篩選重組陽性質粒，每個片段選取5個單克隆菌落，重復進行3次測序。

1.2.4 GP5和NSP2基因序列的遺傳進化分析 應用生物學分析軟件DNAStar中的Megalign軟件對20株PRRSV毒株及參考毒株進行序列比對及同源性分析，應用MEGA5.2軟件對擴增的GP5和NSP2核苷酸序列進行遺傳進化分析。

2 結果

2.1 PRRSV的RT-PCR鑒定 本研究對2013-2014年東北地區3個省份29個地區的123份疑似PRRSV感染豬的病料樣品進行了RT-PCR鑒定，結果顯示：123份病料樣品中有20份陽性樣品，PRRSV陽性率為16%。

2.2 GP5和NSP2基因片段的擴增與序列測定 利用設計的2對特異性引物分別擴增20株PRRSV陽性樣品的GP5和NSP2基因，PCR產物與pMD18-T載體連接、轉化，篩選重組陽性質粒并測序。測序結果顯示，所有毒株GP5基因擴增產物均為711 bp，19株病毒株的部分NSP2基因擴增產物為762 bp，其中HLJ13株NSP2基因PCR擴增產物有兩條目的條帶，分別為762 bp和852 bp。

2.3 GP5遺傳進化分析2.3.1 GP5基因遺傳進化樹及同源性分析 GP5基因遺傳進化樹結果顯示，所有毒株均屬于北美洲型，其中18株屬于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，與HuN4和JXA1同屬于一個亞群，2株(HLJ13和LN283)屬于經典PRRSV，與國內經典株CH-1a同屬于一個亞群(圖1)。

黑色圓點(●)：測序株圖1 GP5基因的遺傳進化樹

與國內外已發表的10株PRRSV進行同源性分析發現，GP5基因核苷酸同源性為84.4%～100%，推導的氨基酸同源性為83.1%～100%；與經典株CH-1a、VR-2332株相比，核苷酸同源性為86.2%～100%，氨基酸同源性為85.1%～100%；與HP-PRRSV中的代表株HuN4和JXA1株的核苷酸同源性為91.5%～99.8%，氨基酸同源性為90%～99.5%；與疫苗株MLV RespPRRS/Repro和Prime Pac相比，核苷酸同源性為85.9%～92.7%，氨基酸同源性為84.1%～94.5%。2.3.2 GP5蛋白氨基酸序列分析 GP5測序結果顯示，所有毒株的GP5基因全長均為603 bp，編碼200個氨基酸，不存在氨基酸的缺失和插入。應用Megalign軟件對這21株病毒株GP5基因進行序列比對分析，與CH-1a、VR-2332和HuN4相比，部分毒株GP5蛋白在氨基酸高變區、中和表位和誘導表位存在多處氨基酸的變異(圖2)，主要變異位點為C24→Y24，F25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34。

2.4 NSP2遺傳進化分析

2.4.1 NSP2基因遺傳進化樹及同源性分析 NSP2基因遺傳進化樹結果顯示，與國內外已發表的18個參考株相比，所研究的20個毒株的NSP2，19個與HUN4和JXA1同屬于HP-PRRSV亞群，HLJ13-NSP2-762和LN283屬于HuN4亞群，而HLJ13-NSP2-852與國內經典株CH-1a同屬于一個亞群(圖3)。將這20個NSP2基因與國內外已發表的10株PRRSV進行同源性分析發現，NSP2基因的核苷酸同源性為67.1%～99.8%，氨基酸同源性為54.4%～99.3%。與CH-1a相比，核苷酸同源性為85.8%～90.7%，推導的氨基酸同源性分別為79.9%～87.4%；與經典株VR-2332相比，核苷酸同源性為75.9%～79.6%，氨基酸同源性為67.8%～71.1%；與HP-PRRSV株HuN4和JXA1相比，20株病毒株的核苷酸具有90.4%～99.8%高度同源性。

2.4.2 NSP2蛋白氨基酸序列分析 NSP2氨基酸序列比對分析顯示：與CH-1a、VR-2332和HuN4相比，HLJ13NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入現象；HLJ1、HLJ13-NSP2-762、HLJ124、HLJ270、HLJ298、HLJ461、HLJ486、HLJ511、HLJ556、HLJ558、HLJ563、HLJ590、HLJ610、JL315、JL543、JL559、JL620、LN1、LN283、LN609與HuN4和JXA1一樣在481位缺失一個氨基酸，在532～560處缺失29個氨基酸，除此之外HLJ558在487～490處還缺失4個氨基酸(圖4)。

黑色三角(▲)：測序株圖3 NSP2基因的遺傳進化樹

3 討論與小結

3.1 GP5遺傳衍變特征 GP5是重要的糖基化蛋白，也是變異最為顯著的結構蛋白[9]。GP5基因遺傳進化結果顯示，本研究測序鑒定的病毒株均屬于北美洲型毒株，所研究的20個病毒株中，18株屬于HP-PRRSV，HLJ13株和LN283株屬于經典PRRSV。GP5氨基酸序列分析表明，與經典株CH-1a、VR-2332和高致病性株HuN4相比，本實驗所研究的GP5在鄰近信號肽序列外區近端的氨基酸高變區[10](aa24～aa39)、中和抗原表位(aa37～aa45)和誘導表位(aa27～aa30)存在氨基酸的變異。HuN4亞群的18個病毒株的GP5氨基酸C24F25→Y24F25，HLJ13株L28→I28，HLJ486株L28→P28；與CH-1a相比，HLJ556、HLJ590、JL543、JL620、LN609的GP5氨基酸V29→A29；部分毒株氨基酸N34→D34/S34/G34。HLJ13株和LN283株的aa39與經典株CH-1a一樣，aa39為F39，其余均為I39。aa34是糖基化位點，它的變異可能導致部分毒株失去一個糖基化位點且aa34的突變可能會影響病毒顆粒的產生和病毒的感染性從而引起病毒效價下降[11]。

3.2 NSP2遺傳衍變特征 NSP2是具有高度免疫原性的非結構蛋白，NSP2的變異主要表現為氨基酸的缺失與插入。Shen等[12]于2000年首次報道與VR-2332相比，PRRSV北美洲型SP株在813～814處插入了36個氨基酸。2006年中國暴發的以高熱、高發病率、高死亡率為特征的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，NSP2分別在481位和532～560處缺失30個氨基酸[13]。2014年Choi等[14]研究韓國PRRSV分離株NSP2存在392和393個核苷酸的缺失。有報道表明NSP2的缺失可能在宿主免疫方面具有至關重要的作用[7]。20個病毒株NSP2遺傳進化及氨基酸序列比對分析顯示：與CH-1a、VR-23323和HuN4相比，HLJ13-NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入現象，屬于CH-1a經典亞群，HLJ13-NSP2-762則屬于HP-PRRSV亞群。與LN283-GP5屬于經典PRRSV不同，LN283-NSP2和其余17個病毒株的NSP2與HP-PRRSV代表株HuN4和JXA1高度同源，且均存在30個不連續氨基酸的缺失，除此之外HLJ558在487～490處還缺失4個氨基酸。由于HLJ13-NSP2-762和HLJ-13-852分別處于不同的亞群，HLJ13株可能為經典和高致病性混合感染株。LN283株GP5和NSP2基因遺傳進化樹的不同結果表明，LN283株可能涉及PRRSV基因組重組。因此，HLJ13和LN283株的遺傳變異情況需要我們進行進一步的探索和研究。

豬繁殖與呼吸綜合征是影響我國乃至世界養豬業健康、持續發展的重要傳染病之一。20個病毒株GP5和部分NSP2基因的遺傳進化及序列比對分析結果表明我國東北地區PRRSV具有更為復雜的遺傳多樣性。而且，在自然界和免疫壓力下，PRRSV的變異速度有所增加。因此，對東北地區PRRSV分子流行病學的調查和監測有助于及時發現和防治新型PRRSV，為我國PRRSV防控提供重要的參考依據。

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(編 輯：李文平)

Genetic Variation Analysis of GP5 and NSP2 of PRRSV in Northeast China from 2013 to 2014

CHANG Xiao-bo1,2, YE Chao2, ZHAO Kuan2, JIANG Cheng-gang2, CAI Xue-hui2,ZHANG Hui1*, AN Tong-qing2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China)

To investigate the genetic variation of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRSV) in Northeast China included 29 regions of 3 provinces from 2013 to 2014,123 tissue samples collected from Northeast China were tested, the GP5 and partial NSP2 genes of 20 positive samples were amplified, sequenced, phylogenetic and alignment analyzed, respectively. The results showed that the PRRSV positive rate was 16%, GP5 genesshared 84.4%～100% nucleotide similarity compared with 10 domestic and overseas reference PRRSV strains. Amino acid analysis of GP5 revealed that most strains had mutations, especially in the hyper-variable regions, the primary neutralizing epitope and decoy epitope, which were C24→Y24，F25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34. The phylogenetic of GP5 and NSP2 of LN283 indicated the strain could be genetic recombination strain.The result of PCR on HLJ13 showed NSP2 had two genes which differed 90 bp, and the phylogenetic of NSP2 showed they belonged to CH-1a and HuN4 subgroup, which could be polyinfection involved of classical and highly pathogenic strain. The phylogenetic and amino acid analysis of GP5 and NSP2 demonstrate all strains belonged to North American genotype, which gave priority to HP-PRRSV, coexisting of classic strains and mutant strains. The study would provide a new reference on genetic evolution and disease control for PRRSV in Northeast China.

PRRSV; GP5; NSP2; genetic variation

國家自然科學基金(31270045)；吉林省科技廳自然科學基金項目(20150101107JC)

常曉博，碩士研究生，從事PRRSV分子流行病學研究。

張輝，E-mail：huizhang01525@163.com；安同慶，E-mail：antongqing@163.com

2015-04-14

A

1002-1280 (2015) 08-0001-06

S858.28