2013-2014年我國(guó)東北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和NSP2基因遺傳變異分析

常曉博，葉超，趙款，姜成剛，王淑杰，蔡雪輝，張輝，安同慶*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

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2013-2014年我國(guó)東北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5和NSP2基因遺傳變異分析

常曉博1,2，葉超2，趙款2，姜成剛2，王淑杰2，蔡雪輝2，張輝1*，安同慶2*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

為了解2013-2014年我國(guó)東北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的遺傳變異情況，研究對(duì)東北地區(qū)3個(gè)省份29個(gè)地區(qū)采集的123份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)20份陽(yáng)性樣品的GP5和部分NSP2基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序、遺傳進(jìn)化及序列比對(duì)分析。結(jié)果表明：我國(guó)東北地區(qū)PRRSV陽(yáng)性率為16%，與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的10株P(guān)RRSV參考株相比，GP5基因的核苷酸同源性為84.4%～100%。GP5氨基酸序列分析表明，大多數(shù)毒株在氨基酸高變區(qū)、中和表位和誘導(dǎo)表位發(fā)生了變異，主要變異為：C24→Y24，F(xiàn)25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34。LN283株GP5和NSP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)的不同結(jié)果表明，LN283株可能涉及PRRSV基因重組。HLJ13株NSP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有2條相差90 bp的目的條帶，且NSP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示兩條序列分別屬于CH-1a亞群和HuN4亞群，推斷HLJ13株可能為經(jīng)典和高致病性混合感染株。GP5和NSP2遺傳進(jìn)化及氨基酸序列分析結(jié)果表明，所有病毒株均屬于北美洲型，且以HP-PRRSV為主，經(jīng)典株與變異株共存。本研究結(jié)果可為我國(guó)東北地區(qū)PRRSV遺傳進(jìn)化研究及疫病防控提供參考。

PRRSV；GP5；NSP2；遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一種廣泛流行且嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的以繁殖障礙和呼吸道癥狀為特征的傳染病[1-2]，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus, PRRSV)。根據(jù)抗原性差異，PRRSV可分為兩個(gè)血清型：基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。目前該病在世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家均有發(fā)生，我國(guó)主要流行株為基因Ⅱ型，即北美洲型[4]。

PRRSV在自然界和免疫壓力下極易發(fā)生變異和基因重組，其毒力由多基因控制，并且存在于病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中。PRRSV基因組中，ORF5是高變區(qū)之一，其編碼的GP5蛋白是最主要的保護(hù)性抗原蛋白[5]，并且具有受體識(shí)別作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[6]。PRRSV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中，NSP2最易發(fā)生變異和缺失。歐洲型和北美洲型NSP2高變區(qū)氨基酸缺失的報(bào)道[7]表明NSP2對(duì)于病毒的復(fù)制不具有決定性作用但在宿主免疫方面可能具有至關(guān)重要的作用。Kappes等[8]通過(guò)免疫電子顯微技術(shù)觀察到NSP2與PRRSV的病毒粒子相關(guān)；通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析得到NSP2以多種亞型參與了病毒粒子的構(gòu)成。在PRRSV基因組中GP5和NSP2基因是最易發(fā)生變異的，因此針對(duì)GP5和NSP2基因變異的研究可以在一定程度上反應(yīng)PRRSV整個(gè)基因組的變異情況。

本研究對(duì)東北地區(qū)3個(gè)省份29個(gè)地區(qū)的123株P(guān)RRSV進(jìn)行PT-PCR檢測(cè)，并對(duì)20株陽(yáng)性樣品GP5和NSP2基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化及序列分析，從而了解2013-2014年?yáng)|北地區(qū)PRRSV的遺傳變異情況，為東北P(pán)RRSV的防制及分子流行情況提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 來(lái)源于我國(guó)東北地區(qū)3個(gè)省份29個(gè)地區(qū)中小型規(guī)?；i場(chǎng)送檢的豬的肺臟、淋巴結(jié)、腎臟和脾臟。

1.1.2主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV、Recombinant RNase Inhibitor、TaKaRa EX Taq Hot Start Version、pMD18-T Vector Kit、E.coliDH5a感受態(tài)均購(gòu)自寶生物工程(TaKaRa)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已登錄的國(guó)內(nèi)外經(jīng)典PRRSV毒株NSP2和GP5序列的保守區(qū)，以HuN4(GenBank no. EF635006)為模板，設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增部分NSP2基因和完整GP5基因的特異性引物(表1)。

表1 NSP2和GP5的擴(kuò)增引物

1.2.2 病料處理與RT-PCR鑒定 取豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織剪碎、研磨、制成勻漿，反復(fù)凍融3次，以8000 r/min離心3 min，取200 uL上清液按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，然后按照EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix操作說(shuō)明對(duì)所檢病料進(jìn)行PRRSV鑒定。

1.2.3 PRRSV陽(yáng)性樣品GP5和NSP2基因的擴(kuò)增與測(cè)序 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作手冊(cè)提取PRRSV陽(yáng)性樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用于全長(zhǎng)GP5和部分NSP2基因的擴(kuò)增。利用膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并與pMD18-T載體16 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化并篩選重組陽(yáng)性質(zhì)粒，每個(gè)片段選取5個(gè)單克隆菌落，重復(fù)進(jìn)行3次測(cè)序。

1.2.4 GP5和NSP2基因序列的遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用生物學(xué)分析軟件DNAStar中的Megalign軟件對(duì)20株P(guān)RRSV毒株及參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)及同源性分析，應(yīng)用MEGA5.2軟件對(duì)擴(kuò)增的GP5和NSP2核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV的RT-PCR鑒定 本研究對(duì)2013-2014年?yáng)|北地區(qū)3個(gè)省份29個(gè)地區(qū)的123份疑似PRRSV感染豬的病料樣品進(jìn)行了RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示：123份病料樣品中有20份陽(yáng)性樣品，PRRSV陽(yáng)性率為16%。

2.2 GP5和NSP2基因片段的擴(kuò)增與序列測(cè)定 利用設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增20株P(guān)RRSV陽(yáng)性樣品的GP5和NSP2基因，PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化，篩選重組陽(yáng)性質(zhì)粒并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，所有毒株GP5基因擴(kuò)增產(chǎn)物均為711 bp，19株病毒株的部分NSP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物為762 bp，其中HLJ13株NSP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有兩條目的條帶，分別為762 bp和852 bp。

2.3 GP5遺傳進(jìn)化分析2.3.1 GP5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)及同源性分析 GP5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，所有毒株均屬于北美洲型，其中18株屬于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，與HuN4和JXA1同屬于一個(gè)亞群，2株(HLJ13和LN283)屬于經(jīng)典PRRSV，與國(guó)內(nèi)經(jīng)典株CH-1a同屬于一個(gè)亞群(圖1)。

黑色圓點(diǎn)(●)：測(cè)序株圖1 GP5基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的10株P(guān)RRSV進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，GP5基因核苷酸同源性為84.4%～100%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為83.1%～100%；與經(jīng)典株CH-1a、VR-2332株相比，核苷酸同源性為86.2%～100%，氨基酸同源性為85.1%～100%；與HP-PRRSV中的代表株HuN4和JXA1株的核苷酸同源性為91.5%～99.8%，氨基酸同源性為90%～99.5%；與疫苗株MLV RespPRRS/Repro和Prime Pac相比，核苷酸同源性為85.9%～92.7%，氨基酸同源性為84.1%～94.5%。2.3.2 GP5蛋白氨基酸序列分析 GP5測(cè)序結(jié)果顯示，所有毒株的GP5基因全長(zhǎng)均為603 bp，編碼200個(gè)氨基酸，不存在氨基酸的缺失和插入。應(yīng)用Megalign軟件對(duì)這21株病毒株GP5基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，與CH-1a、VR-2332和HuN4相比，部分毒株GP5蛋白在氨基酸高變區(qū)、中和表位和誘導(dǎo)表位存在多處氨基酸的變異(圖2)，主要變異位點(diǎn)為C24→Y24，F(xiàn)25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34。

2.4 NSP2遺傳進(jìn)化分析

2.4.1 NSP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)及同源性分析 NSP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的18個(gè)參考株相比，所研究的20個(gè)毒株的NSP2，19個(gè)與HUN4和JXA1同屬于HP-PRRSV亞群，HLJ13-NSP2-762和LN283屬于HuN4亞群，而HLJ13-NSP2-852與國(guó)內(nèi)經(jīng)典株CH-1a同屬于一個(gè)亞群(圖3)。將這20個(gè)NSP2基因與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的10株P(guān)RRSV進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，NSP2基因的核苷酸同源性為67.1%～99.8%，氨基酸同源性為54.4%～99.3%。與CH-1a相比，核苷酸同源性為85.8%～90.7%，推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為79.9%～87.4%；與經(jīng)典株VR-2332相比，核苷酸同源性為75.9%～79.6%，氨基酸同源性為67.8%～71.1%；與HP-PRRSV株HuN4和JXA1相比，20株病毒株的核苷酸具有90.4%～99.8%高度同源性。

2.4.2 NSP2蛋白氨基酸序列分析 NSP2氨基酸序列比對(duì)分析顯示：與CH-1a、VR-2332和HuN4相比，HLJ13NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入現(xiàn)象；HLJ1、HLJ13-NSP2-762、HLJ124、HLJ270、HLJ298、HLJ461、HLJ486、HLJ511、HLJ556、HLJ558、HLJ563、HLJ590、HLJ610、JL315、JL543、JL559、JL620、LN1、LN283、LN609與HuN4和JXA1一樣在481位缺失一個(gè)氨基酸，在532～560處缺失29個(gè)氨基酸，除此之外HLJ558在487～490處還缺失4個(gè)氨基酸(圖4)。

黑色三角(▲)：測(cè)序株圖3 NSP2基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論與小結(jié)

3.1 GP5遺傳衍變特征 GP5是重要的糖基化蛋白，也是變異最為顯著的結(jié)構(gòu)蛋白[9]。GP5基因遺傳進(jìn)化結(jié)果顯示，本研究測(cè)序鑒定的病毒株均屬于北美洲型毒株，所研究的20個(gè)病毒株中，18株屬于HP-PRRSV，HLJ13株和LN283株屬于經(jīng)典PRRSV。GP5氨基酸序列分析表明，與經(jīng)典株CH-1a、VR-2332和高致病性株HuN4相比，本實(shí)驗(yàn)所研究的GP5在鄰近信號(hào)肽序列外區(qū)近端的氨基酸高變區(qū)[10](aa24～aa39)、中和抗原表位(aa37～aa45)和誘導(dǎo)表位(aa27～aa30)存在氨基酸的變異。HuN4亞群的18個(gè)病毒株的GP5氨基酸C24F25→Y24F25，HLJ13株L28→I28，HLJ486株L28→P28；與CH-1a相比，HLJ556、HLJ590、JL543、JL620、LN609的GP5氨基酸V29→A29；部分毒株氨基酸N34→D34/S34/G34。HLJ13株和LN283株的aa39與經(jīng)典株CH-1a一樣，aa39為F39，其余均為I39。aa34是糖基化位點(diǎn)，它的變異可能導(dǎo)致部分毒株失去一個(gè)糖基化位點(diǎn)且aa34的突變可能會(huì)影響病毒顆粒的產(chǎn)生和病毒的感染性從而引起病毒效價(jià)下降[11]。

3.2 NSP2遺傳衍變特征 NSP2是具有高度免疫原性的非結(jié)構(gòu)蛋白，NSP2的變異主要表現(xiàn)為氨基酸的缺失與插入。Shen等[12]于2000年首次報(bào)道與VR-2332相比，PRRSV北美洲型SP株在813～814處插入了36個(gè)氨基酸。2006年中國(guó)暴發(fā)的以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，NSP2分別在481位和532～560處缺失30個(gè)氨基酸[13]。2014年Choi等[14]研究韓國(guó)PRRSV分離株NSP2存在392和393個(gè)核苷酸的缺失。有報(bào)道表明NSP2的缺失可能在宿主免疫方面具有至關(guān)重要的作用[7]。20個(gè)病毒株NSP2遺傳進(jìn)化及氨基酸序列比對(duì)分析顯示：與CH-1a、VR-23323和HuN4相比，HLJ13-NSP2-852不存在氨基酸的缺失和插入現(xiàn)象，屬于CH-1a經(jīng)典亞群，HLJ13-NSP2-762則屬于HP-PRRSV亞群。與LN283-GP5屬于經(jīng)典PRRSV不同，LN283-NSP2和其余17個(gè)病毒株的NSP2與HP-PRRSV代表株HuN4和JXA1高度同源，且均存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸的缺失，除此之外HLJ558在487～490處還缺失4個(gè)氨基酸。由于HLJ13-NSP2-762和HLJ-13-852分別處于不同的亞群，HLJ13株可能為經(jīng)典和高致病性混合感染株。LN283株GP5和NSP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)的不同結(jié)果表明，LN283株可能涉及PRRSV基因組重組。因此，HLJ13和LN283株的遺傳變異情況需要我們進(jìn)行進(jìn)一步的探索和研究。

豬繁殖與呼吸綜合征是影響我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展的重要傳染病之一。20個(gè)病毒株GP5和部分NSP2基因的遺傳進(jìn)化及序列比對(duì)分析結(jié)果表明我國(guó)東北地區(qū)PRRSV具有更為復(fù)雜的遺傳多樣性。而且，在自然界和免疫壓力下，PRRSV的變異速度有所增加。因此，對(duì)東北地區(qū)PRRSV分子流行病學(xué)的調(diào)查和監(jiān)測(cè)有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和防治新型PRRSV，為我國(guó)PRRSV防控提供重要的參考依據(jù)。

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(編 輯：李文平)

Genetic Variation Analysis of GP5 and NSP2 of PRRSV in Northeast China from 2013 to 2014

CHANG Xiao-bo1,2, YE Chao2, ZHAO Kuan2, JIANG Cheng-gang2, CAI Xue-hui2,ZHANG Hui1*, AN Tong-qing2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China)

To investigate the genetic variation of pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRSV) in Northeast China included 29 regions of 3 provinces from 2013 to 2014,123 tissue samples collected from Northeast China were tested, the GP5 and partial NSP2 genes of 20 positive samples were amplified, sequenced, phylogenetic and alignment analyzed, respectively. The results showed that the PRRSV positive rate was 16%, GP5 genesshared 84.4%～100% nucleotide similarity compared with 10 domestic and overseas reference PRRSV strains. Amino acid analysis of GP5 revealed that most strains had mutations, especially in the hyper-variable regions, the primary neutralizing epitope and decoy epitope, which were C24→Y24，F(xiàn)25→L25，V27→A27，L28→I28，N34→G34/S34/D34. The phylogenetic of GP5 and NSP2 of LN283 indicated the strain could be genetic recombination strain.The result of PCR on HLJ13 showed NSP2 had two genes which differed 90 bp, and the phylogenetic of NSP2 showed they belonged to CH-1a and HuN4 subgroup, which could be polyinfection involved of classical and highly pathogenic strain. The phylogenetic and amino acid analysis of GP5 and NSP2 demonstrate all strains belonged to North American genotype, which gave priority to HP-PRRSV, coexisting of classic strains and mutant strains. The study would provide a new reference on genetic evolution and disease control for PRRSV in Northeast China.

PRRSV; GP5; NSP2; genetic variation

國(guó)家自然科學(xué)基金(31270045)；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101107JC)

常曉博，碩士研究生，從事PRRSV分子流行病學(xué)研究。

張輝，E-mail：huizhang01525@163.com；安同慶，E-mail：antongqing@163.com

2015-04-14

A

1002-1280 (2015) 08-0001-06

S858.28