酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定豬、雞糞便中11種β-受體激動(dòng)劑殘留

周悅榕，李丹妮，顧欣，嚴(yán)鳳，吳劍平，張?chǎng)?/p>

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

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酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定豬、雞糞便中11種β-受體激動(dòng)劑殘留

周悅榕，李丹妮，顧欣，嚴(yán)鳳，吳劍平，張?chǎng)?/p>

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

以市售β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒為基礎(chǔ)，建立了可同時(shí)測(cè)定豬、雞糞便中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、卡布特羅、馬噴特羅、吡布特羅、西馬特羅、西布特羅、克侖潘特11種β2-受體激動(dòng)劑的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析法。該方法對(duì)豬、雞糞便樣品的檢出限為5 ng/g，豬糞便樣品的添加回收率為57.3%～247.4%，雞糞便樣品的添加回收率為89.3%～177.3%，豬糞便樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～14.3%，雞糞便樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～23.5%。

β2-受體激動(dòng)劑;多殘留;豬糞便;雞糞便;酶聯(lián)免疫吸附分析法

β2-受體激動(dòng)劑屬苯乙胺類藥物。因其具有“脂肪再分配效應(yīng)”，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率與提高酮體瘦肉率而被非法用于畜牧生產(chǎn)[1-2]。人類經(jīng)食物鏈攝入含藥物殘留的動(dòng)物源性食品會(huì)引發(fā)肌肉震顫、心律失常、眩暈乏力等中毒癥狀危及人類健康[3]。我國(guó)相繼出臺(tái)了農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告[4]、193號(hào)公告[5]、235號(hào)公告[6]、1519號(hào)公告[7]等一系列法律法規(guī)，力爭(zhēng)從動(dòng)物飲用水、飼料等源頭遏制其非法使用。

一直以來，動(dòng)物肌肉、內(nèi)臟、奶、蛋、尿液與血漿是獸藥殘留檢測(cè)中常見的樣品類型，但均存在采集工序繁瑣、采樣風(fēng)險(xiǎn)與成本高、樣品再利用率較低等問題。故近年來，探索新型活體檢材(如：毛發(fā)[8]、唾液[9]、視網(wǎng)膜[10])逐漸成為獸藥殘留分析研究的新方向。目前，已有從動(dòng)物糞便中測(cè)定抗生素殘留的相關(guān)報(bào)道[11,12]，但尚沒有將其作為違禁物質(zhì)殘留測(cè)定對(duì)象的相關(guān)報(bào)道。動(dòng)物糞便是另一種重要的動(dòng)物代謝產(chǎn)物載體，其采集方式更靈活便捷，可操作性強(qiáng)。據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明部分藥物在豬糞便中代謝殘留量明顯高于豬尿中的殘留量。故糞便樣品可否作為獸藥殘留分析研究的新型活體檢材需進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)動(dòng)物源性食品中β2-受體激動(dòng)劑類藥物分析方法的報(bào)道已有很多，主要有膠體金免疫層析法[13]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、液相色譜法[17]、離子色譜[18]、毛細(xì)管電泳法[19]與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20]等。其中酶聯(lián)免疫吸附分析法因其簡(jiǎn)便、靈敏、快速、大通量等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于日常監(jiān)測(cè)和篩查工作。但目前報(bào)道的β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫檢測(cè)法大部分僅限于單個(gè)藥物。故建立一個(gè)便捷、快速、高效的β2-受體激動(dòng)劑多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法顯得尤為必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 BioTek ELX808酶標(biāo)儀,帶450 nm波長(zhǎng)濾光片，美國(guó)伯騰儀器公司，美國(guó)；BioTek Gen 5.0TM數(shù)據(jù)分析軟件,美國(guó)伯騰儀器公司，美國(guó)；PL202-L感量為0.01g電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海；AB135-S感量為0.00001g電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(jī),美國(guó)BECKMAN COULTER公司，美國(guó)；KS-260漩渦振蕩器,德國(guó)IKA公司，德國(guó)；MILLIPORE A10超純水系統(tǒng),密理博(上海)貿(mào)易有限公司，上海；TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器,北京踏棉科技有限公司，北京。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 硫酸特布他林(Terbutaline Hemisulfate，純度≥ 100 %，批號(hào)：095K1629)購(gòu)自sigma公司、鹽酸克侖特羅(Clenbuterol Hydrochloride，純度≥ 98.5 %，批號(hào)：20223)、沙丁胺醇(Salbutamol，純度≥ 99.00 %，批號(hào)：20618)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司、溴布特羅(Brombuterol，純度≥ 100 %，批號(hào)：080415)、鹽酸馬布特羅(Mabuterol Hydrochloride，純度≥ 99 %，批號(hào)：120805)、醋酸卡布特羅(Carbuterol Acetate，純度98.5 %，批號(hào)：261533)、鹽酸馬噴特羅(Mapenterol Hydrochloride，純度≥ 99 %，批號(hào)：061005)、醋酸吡布特羅(Pirbuterol Acetate，純度99.9 %，批號(hào)：241741)、西馬特羅(Cimaterol，純度≥ 99 %，批號(hào)：071105)、西布特羅(Cimbuterol，純度≥100 %，批號(hào)：241418)、克侖潘特鹽酸鹽(Clenpenterol Hydrochloride，純度99.5 %，批號(hào)：241840)均購(gòu)自witega公司。

1.2.2 試劑 β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)：269534，英國(guó)朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司)；氫氧化鈉、鹽酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；甲醇 (色譜純，美國(guó)Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)水。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 分別精密稱取11種β2-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品含藥物質(zhì)量為0.01 g(精確至0.00001 g)，用適量甲醇溶解并定容10 mL，配制成含藥物濃度各為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冷藏保存，有效期6個(gè)月。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理步驟 稱取豬、雞糞便樣品(2±0.01) g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液提取，充分混勻，振蕩10 min，離心5 min (9000 r/min)。取出全部提取液于另一支50 mL離心管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣液的pH值范圍為7～9，離心5 min (9000 r/min)，取50 μL上清液供β2-受體激動(dòng)劑的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)。

1.3.2 試劑盒檢測(cè)步驟 參見英國(guó)朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫試劑盒產(chǎn)品說明書。

1.3.3 檢測(cè)限和定量限 將不同來源的豬、雞糞便空白樣品各20份，按照1.3.1和1.3.2確定的方法處理并測(cè)定，計(jì)算豬糞、雞糞空白樣品測(cè)定平均值，并對(duì)應(yīng)加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即為β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫分析篩選檢測(cè)方法的檢測(cè)限[21]。方法定量限的確定過程參照《關(guān)于發(fā)布<獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案審查技術(shù)資料要求>和<獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)參考評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)>的通知》[21]的要求。

1.3.4 準(zhǔn)確度和精密度 向豬、雞糞便空白樣品中分別準(zhǔn)確加入一定質(zhì)量濃度的11種β2-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品，添加濃度為分別為定量限和2倍定量限[21]。添加樣品按照1.3.1和1.3.2確定的方法處理并測(cè)定，批內(nèi)相同的質(zhì)量濃度水平做5次平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3個(gè)批次，計(jì)算11種β2-受體激動(dòng)劑的加標(biāo)回收率(R / %)及批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

(RSD/ %)。11種β2-受體激動(dòng)劑的加標(biāo)回收率應(yīng)40%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)30%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)40%[21]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 質(zhì)量濃度為0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2的試劑盒檢測(cè)步驟測(cè)定，使用BioTek Gen 5.0TM數(shù)據(jù)分析軟件采用4參數(shù)擬合方程，以克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以450 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和表1，IC50數(shù)值為0.456 ng/mL。

圖1 豬、雞糞便的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

曲線名稱曲線公式ABCDR2IC50值/(ng·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=(A-D)/(1+(X/C)^B)+D1.120.9060.4560.180.9970.456

2.2 50 %抑制濃度(IC50)范圍 重復(fù)測(cè)定20條標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)計(jì)IC50測(cè)定值，測(cè)定結(jié)果見表2。確定IC50的變化范圍為0.456 ～ 0.903 ng/mL。

表2 20條標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50濃度統(tǒng)計(jì)表(單位：ng·mL-1)

2.3 交叉反應(yīng)率 酶聯(lián)免疫吸附分析法的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)反映了該檢測(cè)方法在一個(gè)多元混合體系中檢測(cè)出目標(biāo)化合物的能力，即抗體是否對(duì)特定分析物表現(xiàn)顯著的特異性，能夠區(qū)別干擾成分與特定分析物結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化。通過比較待測(cè)物與其結(jié)構(gòu)或功能類似物之間的測(cè)定交叉反應(yīng)率考察檢測(cè)方法的特異性[22]。本試驗(yàn)中11種β2-受體激動(dòng)劑與克侖特羅抗體、沙丁胺醇抗體的交叉反應(yīng)率參見英國(guó)朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫試劑盒產(chǎn)品說明書見表3。由產(chǎn)品說明書提供的結(jié)果得知試劑盒所用抗體與11種β2-受體激動(dòng)劑均產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故該抗體可用于11種β2-受體激動(dòng)劑的多殘留檢測(cè)。

表3 11種β2-受體激動(dòng)劑與克侖特羅抗體、

2.4 檢測(cè)限和定量限 選擇豬、雞糞便空白樣品各20份考察檢測(cè)限見表4。并考察了以5 ng/g為豬糞便樣品中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、卡布特羅、馬噴特羅、克侖潘特、西布特羅的定量限，以10 ng/g為豬糞便樣品中吡布特羅、西馬特羅的定量限。以5 ng/g為雞糞便樣品中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、克侖潘特、西布特羅的定量限，以10 ng/g為雞糞便樣品中卡布特羅、馬噴特羅、吡布特羅、西馬特羅的定量限。結(jié)果表明，豬、雞糞便樣品的添加回收率均大于40%，滿足《關(guān)于發(fā)布<獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案審查技術(shù)資料要求>和<獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)參考評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)>的通知》[21]的要求。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度 將11種β2-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品分別以定量限和2倍定量限的添加濃度添加至豬、雞糞便空白樣品中，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，豬糞便添加樣品回收率范圍在57.3%～247.4%之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/n=5)均在0.3%～14.3%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/n=3)均在1.2%～17.4%之間，雞糞便添加樣品回收率范圍在89.3%～177.3% 之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/n=5)均在0.2%～23.5%之間，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/n=3)均在0.3%～20.5%之間。

表5 豬、雞糞便中11種β2-受體激動(dòng)劑批內(nèi)、批間回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 基質(zhì)效應(yīng) 準(zhǔn)確稱取空白豬、雞糞便各(2 ± 0.01) g，按照1.3.1確定的樣品前處理方法處理，得到空白豬、雞糞便基質(zhì)液。分別向其中加入適量的11種β2-受體激動(dòng)劑，配制成含藥物濃度為4 ng/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。同時(shí)，用0.1 mol/L鹽酸溶液(經(jīng)1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7 ～ 9)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品中間液配制成濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.2確定的檢測(cè)步驟進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，計(jì)算兩測(cè)定值之比(Matrix Effect/%)的平均值，以考察豬、雞糞便對(duì)11種β2-受體激動(dòng)劑的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表6。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定 隨機(jī)抽樣上海市奉賢區(qū)、崇明縣不同養(yǎng)殖場(chǎng)的豬糞便樣品30份，雞糞便樣品44份，采用本實(shí)驗(yàn)建立的酶聯(lián)免疫分析篩選檢測(cè)方法與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，每份樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值。實(shí)際樣品經(jīng)酶聯(lián)免疫分析篩選法測(cè)定后發(fā)現(xiàn)1份豬糞便樣品為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果為6.53 ng/g，2份雞糞便樣品為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果分別為6.03 ng/g和6.44 ng/g。所有實(shí)際樣品再經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的畜禽糞便中β2-受體激動(dòng)劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法確證后表明，所有的實(shí)際樣品均為陰性。因此，該法檢測(cè)豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動(dòng)劑的假陽(yáng)性率分別為3.3 %和4.5 %。

表6 雞糞便和豬糞便對(duì)11種β2-受體激動(dòng)劑的

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品前處理步驟的確定 試驗(yàn)充分考慮了β2-受體激動(dòng)劑的化學(xué)性質(zhì)，及對(duì)保護(hù)酶聯(lián)免疫試劑盒內(nèi)包被的抗體的影響，考察了2種不同的樣品提取步驟(提取步驟Ⅰ：先加2 mL 1 moL/L鹽酸水溶液，后加18 mL水，充分混勻并振蕩；提取步驟Ⅱ：直接加20 mL 0.1 moL/L鹽酸水溶液，充分混勻并振蕩)的提取效果和3種不同的上樣pH值(pH值為7、8、9)對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的影響，以確定樣品前處理步驟。研究采用克侖特羅、沙丁胺醇、特布他林40.0 ng/g的雞糞便添加樣品，結(jié)果表明不同的提取方式和不同的上樣pH值對(duì)三種化合物提取回收率沒有顯著的影響，且回收率均能滿足檢測(cè)的要求。因此，考慮到簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，兼顧提高試驗(yàn)效能，選擇使用Ⅱ號(hào)提取步驟和范圍為7～9的上樣pH值。

3.2 基質(zhì)效應(yīng) 在儀器分析中經(jīng)常需要復(fù)雜繁瑣的樣品前處理過程，基于抗體對(duì)分析物的選擇性，酶聯(lián)免疫分析方法通常不需要嚴(yán)格的提取和凈化過程。但是基質(zhì)對(duì)酶聯(lián)免疫分析的干擾可能很大。大多數(shù)干擾會(huì)影響分析物與抗體的結(jié)合，或者改變酶標(biāo)記物的活性，從而影響所建立的酶聯(lián)免疫方法的靈敏度和重現(xiàn)性[22]。結(jié)果表明，豬糞便基質(zhì)中克侖特羅、沙丁胺醇、卡布特羅、西布特羅為基質(zhì)減弱，其余化合物為基質(zhì)增強(qiáng)。雞糞便基質(zhì)中11種β2-受體激動(dòng)劑均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)。

研究在現(xiàn)有的市售β2-受體激動(dòng)劑酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系基礎(chǔ)上建立了一套簡(jiǎn)便、快速且高效的豬、雞糞便中11種β2-受體激動(dòng)劑多殘留的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，適用于對(duì)大量畜禽糞便樣品中β2-受體激動(dòng)劑殘留的快速篩查。對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品需利用液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法等定量方法做進(jìn)一步的確證。

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(編 輯：陳希)

Determination of 11 β2-Agonists Residue in Swine and Chicken Manure by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ZHOU Yue-rong, LI Dan-ni, GU Xin, Yan Fen, WU Jian-ping, ZHANG Xin

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China)

A method for simultaneously detecting clenbuterol hydrochloride, brombuterol, salbutamol, terbutaline hemisulfate, mabuterol hydrochloride, carbuterol acetate, mapenterol hydrochloride, pirbuterol acetate, cimaterol, cimbuterol, clenpenterol hydrochloridein swine and chicken manure by ELISA was developed in accordance with commercial β2-Agonists-Testing ELISA kit.Furthermore, the limit of determination was 5 ng/g.The recoveries of the method in swine manure were from 57.3% to 247.4% withRSDranging from 0.3% to 14.3%, and the recoveries of the method in chicken manure were from 89.3% to 177.3% withRSDranging from 0.2% to 23.5%.

β2-agonists ;mulit- residues ; swine manure ; chicken manure ; ELISA

上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃[滬農(nóng)青字(2014)第2-2號(hào)]

周悅榕，助理畜牧師，從事獸藥殘留檢測(cè)與方法開發(fā)。E-mail:zhou_yuerong@qq.com

2015-05-18

A

1002-1280 (2015) 08-0039-07

S859.84