卵黃抗體三種提取方法的比較研究

張瑩輝，吳思捷，薛麒，梁琦，姚文生，*

(1中國獸醫藥品監察所，北京100081；2中國農業大學動物醫學院，北京100193)

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卵黃抗體三種提取方法的比較研究

張瑩輝1，吳思捷1，薛麒1，梁琦2，姚文生1，*

(1中國獸醫藥品監察所，北京100081；2中國農業大學動物醫學院，北京100193)

運用硫酸銨法、聚乙二醇(PEG)法、冷乙醇法對卵黃抗體進行提取，并使用間接競爭酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法測定所得卵黃抗體的特異性，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測其純度，用Nanodrop2000測其蛋白濃度并計算提取量，比較三種方法所得抗體的特異性、純度和提取量。結果顯示，三種提取方法所得卵黃抗體特異性高低依次為硫酸銨法、冷乙醇法、PEG法；純度高低依次為硫酸銨法、冷乙醇法、PEG法；三種方法的提取量高低依次為PEG法、硫酸銨法、冷乙醇法。經綜合分析與評價，硫酸銨法的抗體特異性較好、純度較高、提取量也較高，且其操作方法相對簡便，是比較具有優勢的提取方法。

卵黃抗體；提取；硫酸銨法；聚乙二醇法；冷乙醇法

卵黃抗體(Egg yolk antibodies，IgY)是指免疫后禽類卵黃中存在的抗體，是由禽類血液中的特異性抗體

(IgG、IgA、IgM等)轉移至卵黃中對子代產生保護性作用的抗體[1]。IgY具有穩定、安全、高效、無毒副作用等優點[2]，主要用于獸藥產品、免疫檢測、生化檢測、人類保健品、化妝品等方面[3]。常用的卵黃抗體提取方法包括有機物沉淀法、有機溶劑沉淀法、水稀釋法、超臨界氣體提取法、去污劑分離法等，不同提取方法各有其優缺點[4]。本研究以沃尼妙林為模式藥物，篩選成本較低且操作相對簡便的硫酸銨法、PEG法、冷乙醇法等三種提取卵黃抗體方法進行比較研究，綜合比較其優缺點，以期為今后工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沃尼妙林高免雞蛋 使用沃尼妙林-BSA抗原[5]注射免疫27周齡普通級產蛋雞3只，每兩周加強免疫1次，共免疫5次。在首免后5 d開始收集雞蛋，并放至4 ℃環境中保存備用。

1.1.2 試劑 Marker-ProteinRuler 2(12kDa-100 kDa)：購自北京全式金生物技術有限公司；沃尼妙林標準品：購自中國獸醫藥品監察所；HRP標記的抗鼠二抗：購自Jackson公司；沃尼妙林-OVA包被原(V-G-OVA)：實驗室前期合成。

1.1.3 儀器與耗材 離心機：購自湘儀離心機有限公司；電子天平：購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；酶標儀：購自北京普朗新技術有限公司；Nanodrop-2000：購自美國Thermo公司；電熱恒溫培養箱：購自海森信實驗儀器有限公司；電泳儀：購自北京市六一儀器廠；96 孔反應板：購自美國Corning Costar 公司；10、200、1000 μL微量移液槍：購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 卵黃液的收集用 75%酒精消毒蛋殼后打開雞蛋，流掉蛋清，用濾紙吸去剩余蛋清，將卵黃液混勻。取10 mL蛋黃液放于離心管中。分別用下述方法提取卵黃抗體。

1.2.2 硫酸銨法提取卵黃抗體 用去離子水7倍稀釋蛋黃，再用3 mL 0.1mol/L HCl調pH至5.2后，4 ℃靜置6 h，12000 r/min離心30 min，過濾取上清液。各取2 mL上清液3份，加入飽和硫酸銨溶液至其終濃度分別為40%、60%、80%，4 ℃過夜后，5000 r/min離心25 min。棄去上清液，將沉淀物分別以2 mL純水復溶，并編號為B40、B60、B80。

1.2.3 聚乙二醇法提取卵黃抗體 蛋黃中加入20 mL 0.1 mol/L的pH為7.6的Tris-HCL緩沖液，混合均勻后加入PEG至其濃度為3.5%(W/V)并充分混合。8000r/min離心25min，取上清液再加入PEG至其終濃度為12%(W/V)并充分混合。12000r/min離心10min，棄去上清液，將沉淀物用10mL0.01mol/L的PBS溶液復溶，再加入PEG至終濃度為12%(W/V)，充分混合。12000r/min離心10min，棄去上清液，將沉淀物用2mLPBS溶液復溶，并編號為P。

1.2.4 冷乙醇法提取卵黃抗體 用去離子水7倍稀釋蛋黃，用3mL0.1mol/LHCl調pH至5.2后，4 ℃靜置6h，12000r/min離心30min，過濾取上清液。再加入95%的冷乙醇，使終濃度至60%(V/V)，4 ℃攪拌30min，置于4 ℃環境下10000r/min離心30min。將沉淀物溶于10mL0.028mol/L的NaCl溶液中，室溫下過濾除脂，濾液中加入95%冷乙醇，使終濃度至30%(V/V)，充分混勻，并在4 ℃環境10000r/min離心30min，再將沉淀物溶解于2mL0.01mol/L的PBS溶液中，并編號為L。

1.2.5 檢測提取量 用Nanodrop2000分別測定樣品B40、B60、B80、P、L的蛋白濃度值，并按照下方公示計算提取量：1.2.6 檢測特異性 采用間接競爭ELISA測定卵黃抗體的IC50，以判斷特異性的優劣。V-G-OVA用CB稀釋液1:5000稀釋，每孔100μL加入酶標板，37 ℃溫育2h。洗板后各孔加入150μL封閉液，37 ℃溫育1h。加入沃尼妙林標準品(500ng/mL)、PBS緩沖液和待檢樣品各50μL，37 ℃溫育30min。洗滌后加入HRP標記的抗鼠二抗，37 ℃溫育30min。加入100μL/孔A+B顯色液室溫下避光顯色15min，加入50μL/孔終止液，測OD450值。

1.2.7 檢測純度 用SDS-PAGE測三種提取方法所得卵黃抗體的純度。樣品前處理：樣品測完蛋白含量后，計算所需抗體樣品量、純水量和5×SDS上樣緩沖液的量。使5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1倍。上樣前要將樣品于沸水中煮3min使蛋白變性；電泳流程：清洗玻璃板→檢測密封性→灌入分離膠→液封→凝固后排水→灌入濃縮膠→插入梳子→凝固后拔出梳子→加電泳液→上樣→電泳(濃縮膠80V，分離膠120V)→考馬斯亮藍染色→脫色。根據marker找到卵黃抗體的重鏈，即67～70kD位置，觀察目的條帶外其他雜帶的多少，以此來判斷所得卵黃抗體的純度。

2 結果與分析

2.1 蛋白濃度測定結果 實驗測得的BSA標準曲線數據：蛋白質濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mg/mL 時，其對應的OD450nm分別為0.581、0.655、0.712、0.807、0.931、1.075、1.195、1.269由此得到的標準曲線如圖1所示。

圖1 測定蛋白質濃度的標準曲線圖

該標準曲線經過線性擬合，得到一次曲線方程為y=1.3637x+0.6346，R2=0.9816，證明測得的標準曲線線性良好，可以作為測定蛋白濃度的參考標準。根據此擬合方程，得到待測樣品濃度，根據樣品體積可計算出每10mL卵黃原液所提取的卵黃抗體量如表1所示。

表1 各種提取方法所得的IgY的濃度及提取量

由表1所示，每10 mL卵黃中卵黃抗體提取量最高的是聚乙二醇法，其次為80%硫酸銨法、60%硫酸銨法、40%硫酸銨法、冷乙醇法。

2.2 卵黃抗體特異性(IC50)測定結果 結果如表2所示。

表2 各種提取方法所得的IgY特異性

由表2所示，60%硫酸銨法提取的卵黃抗體特異性最好，其次為40%硫酸銨法、80%硫酸銨法、冷乙醇法、聚乙二醇法。

2.3 凝膠電泳結果 結果如圖2所示。

B40、B60、B80、P、L為樣品號;M為Marker箭頭所指為IgY重鏈條帶(67～70 kD)圖2 各種提取方法所得的IgY的SDS-PAGE圖譜

由圖2所示，60%硫酸銨法和冷乙醇法的電泳圖中在相對分子量67～70 kD處可見一條明顯且單一的蛋白條帶，且在其他相對分子量處幾乎沒有雜蛋白，說明其提取的IgY純度高，而其他方法的電泳圖中存在較為明顯的多個條帶，說明其提取物含雜質多、純度低。

2.4 三種方法操作過程比較 結果如表3所示。

從操作上來說，PEG法和80%硫酸銨法試劑消耗量均較大，同時PEG法和冷乙醇法要比硫酸銨法多離心1次。另外為防止蛋白變性，冷乙醇法需要在低溫下操作，相對比較繁瑣。

由以上結果可知，60%硫酸銨法所提取的卵黃抗體純度好、特異性高，且相對提取量也較好，應是沃尼妙林卵黃抗體較為理想的提取方法。

表3 各種提取方法操作比較

3 討論與小結

卵黃液的主要成分包括50%水、30%脂肪和20%蛋白質，大多數蛋白質與脂肪結合以脂蛋白形式存在，脂蛋白難溶于水，溶于水的蛋白質包括α蛋白、β蛋白和γ蛋白，其中卵黃免疫球蛋白是屬于γ蛋白，因此除去卵黃中的非水溶性成分是提取卵黃抗體的重點[6]。硫酸銨法可以有效去除卵黃抗體中的雜蛋白，具有生產成本低、環境污染小、抗體回收率高且純度好等優點，如結合超濾等進一步脫鹽處理，應比較適合工業化生產。冷春玲[7]使用超濾膜包對硫酸銨法所得大腸桿菌K88卵黃抗體進行超濾制得冷凍干燥制品，其抗體保持了完整的抗體結構和良好的活性。聚乙二醇進行卵黃抗體沉淀，所用試劑少，操作條件溫和、沉淀效率高(沉淀時間比硫酸銨法和乙醇法都短，不影響離心處理)、不易引起蛋白質失活。鄭立勇[8]在研究大腸桿菌卵黃抗體提取方法時比較得出了聚乙二醇法提取到的卵黃抗體的產量高于氯仿法和辛酸萃取法，但其所得抗體含雜蛋白較多，在對抗體純度不作高要求的情況下，如制作飼料添加劑及其他口服制品時可以適當選擇此方法，但聚乙二醇溶于水后尚無可靠去除方法，其殘留可能對畜禽產生危害[9]，需要引起注意。冷乙醇法所提取的抗體純度較高，優點是其沉淀不需脫鹽處理，缺點是操作時蛋白質易變性，需在低溫下進行，且存在有機溶劑殘留問題和多步離心操作較繁瑣的問題，限制了其工業化應用。本文從提取量、純度、特異性及操作和應用等方面展現了三種不同提取方法的優缺點，希望在日后深入研究和比較更多提取方法的基礎上綜合利用各種提取方法的優勢，克服單一方法的缺陷，建立較全面的抗體提取方法，同時引入如超濾、抽提、色譜、質譜等純化方法，以期探索出更加安全高效的提取工藝，同時應加快制定卵黃抗體的質量標準，以便于加快卵黃抗體的產業化進程，使其在疾病的診斷、防治方面發揮更大的作用。

[1] De MeulengerB，Huyghebaert A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins[J].Food and Agrcultural immunology，2001，13(4)：275-288.

[2] 史同瑞，黃宇翔，蘇永福.卵黃免疫球蛋白的性質與特點[J].動物醫學進展，2010，31(2)：114-117.

[3] 燕海峰，鄧緣，朱立軍，等.家禽卵黃抗體作用機理及應用現狀分析[J].畜禽業，2006，(18)：28-31.

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[8] 鄭立勇，喬彥良，馬鳳龍，等.卵黃抗體不同提取方法的比較[J].黑龍江畜牧獸醫，2009，(1)：106-107.

[9] 張金.聚乙二醇高效水解菌的分離、鑒定及其工程化應用[D].南京：南京農業大學，2012.

(編 輯：侯向輝)

Comparison of Extracting Egg Yolk Antibody by Three Different Methods

ZHANG Ying-hui1,WU Si-jie1，XUE Qi1，LIANG Qi2，YAO Wen-sheng1,*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081，China；2.CollegeofVeterinaryMedicineatCAU，Beijing100193，China)

In our research, egg yolk antibody was extracted by ammonium sulfate method, polyethylene glycol method (PEG) method and cold ethanol method, and its specificity, purity, and the extract quantity were determined by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) method, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method and Nanodrop2000, respectively. The result showed that the specificity and purity of egg yolk extracted by ammonium sulfatemethod was better than that of cold ethanol method which seemed better than PEG method; however, the extracting ratio of egg yolk antibody extracted by three methods from high to low was that PEG method, ammonium sulfate method and cold ethanolmethod. In summary, antibody extracted by the ammonium sulfate method presented good specificity, high purity and ideal extracting ratio with the relatively simple operation, so ithad more advantages than other two methods.

egg yolk antibody; extraction;ammonium sulfatemethod; PEG method; cold ethanol method

張瑩輝，研究實習員，從事動物實驗管理工作；吳思捷，助理研究員，從事動物實驗管理工作。

姚文生。E-mail：yaowensheng@ivdc.org.cn

2015-06-12

A

1002-1280 (2015) 08-0051-04

S852.43