緩激肽受體及NO在卵巢癌中的表達(dá)

陳麗云，鄭麗華，羅 飛，蘇素文，孫錫紅

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊050017；2.河北省正定縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 正定050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計(jì)劃免疫科，河北 正定050800；4.河北省石家莊市婦幼保健院婦產(chǎn)科，河北 石家莊050051）

卵巢癌是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其發(fā)病隱匿，早期無癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是晚期，對(duì)于卵巢癌的治療，傳統(tǒng)的化療方法是紫杉醇＋鉑類［1］，但是多數(shù)患者停藥一段時(shí)間后會(huì)復(fù)發(fā)，這可能與卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚及腫瘤耐藥有關(guān)［2］。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為與卵巢持續(xù)排卵誘發(fā)慢性炎癥有關(guān)。緩激肽（bradykinin，BK）是機(jī)體炎癥時(shí)釋放的一種血管活性肽［3］，通過與細(xì)胞膜上的Bl和B2受體結(jié)合起效［4］。本研究就卵巢癌患者和卵巢良性腫瘤患者經(jīng)手術(shù)切除的腫塊組織中BK受體亞型及其下游的主要信號(hào)分子NO產(chǎn)生的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)進(jìn)行比較，希望找到更好的腫瘤靶位，以改善卵巢癌患者的生存質(zhì)量。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年2月—2012年2月河北省正定縣人民醫(yī)院臨床確診的卵巢癌患者20例，年齡35～58歲，平均（48±3）歲；卵巢良性腫瘤患者20例，年齡30～55歲，平均（47±4）歲；均無高血壓、糖尿病等內(nèi)科疾病及遺傳病史。另選擇同期健康體檢的正常志愿者20例為對(duì)照組，年齡30～55歲，平均（46±4）歲。3組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌組織中B1、B2受體及eEOS、iNOS的表達(dá) 卵巢癌患者和卵巢良性腫瘤患者（因?yàn)檎Ｂ殉步M織難以獲得，故采用患有良性腫瘤的卵巢組織作為對(duì)照），手術(shù)后迅速取部分組織用10%甲醛溶液固定24h，常規(guī)方法制作蠟塊、切片，常規(guī)脫蠟、染色、分色、返藍(lán)、復(fù)染、脫水、透明、封片。于光學(xué)顯微鏡（×400倍）下觀察細(xì)胞的顏色變化。以胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕色顆粒且其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性，否則為陰性。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，根據(jù)每個(gè)視野計(jì)數(shù)以陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞的比例計(jì)算，取平均數(shù)，分為4級(jí)：①強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞比例＞75%；②陽性，陽性細(xì)胞比例25%～75%；③弱陽性，陽性細(xì)胞比例＜25%；④陰性，表示無陽性細(xì)胞。

1.2.2 血清制備及NO含量測(cè)定 卵巢癌患者和健康志愿者靜脈取血5mL，1 500r／min離心10min，分離血清，血清中NO的含量測(cè)定按NO測(cè)定試劑盒的測(cè)定步驟采用硝酸還原酶法測(cè)定其代謝產(chǎn)物的含量，結(jié)果以μmol／L表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)檢查 良性卵巢腫瘤患者的卵巢組織內(nèi)襯單層排列的上皮細(xì)胞，類似正常輸卵管上皮，細(xì)胞無非典型性增生，無結(jié)構(gòu)紊亂。卵巢癌患者的卵巢上皮細(xì)胞構(gòu)成多級(jí)的復(fù)雜分支狀乳頭，上皮細(xì)胞呈復(fù)層、簇狀，核分裂像多見，具有非典型的核和高核／漿比。間質(zhì)內(nèi)可見成簇或單個(gè)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

2.2 B1及B2受體的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，良性卵巢組織中B1受體表達(dá)呈陰性，B2受體表達(dá)呈陽性；卵巢癌組織細(xì)胞中B1和B2受體表達(dá)均呈強(qiáng)陽性（圖2，3）。

2.3 eNOS及iNOS的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，良性卵巢組織中eNOS表達(dá)呈弱陽性，iNOS表達(dá)呈陰性；卵巢癌組織細(xì)胞中eNOS及iNOS表達(dá)均呈強(qiáng)陽性（圖4，5）。

2.4 血清中NO含量測(cè)定 卵巢癌患者血清中NO含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖6）。

圖1 卵巢組織的組織病理（HE×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 1 Ovarian tissue pathology（HE×400）

圖2 卵巢組織中B1受體的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 2 B1receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖3 卵巢組織中B2受體的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 3 B2receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖4 卵巢組織中eNOS的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 4eNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖5 卵巢組織中iNOS的表達(dá)（免疫組織化學(xué) ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 5 iNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖6 對(duì)照組與卵巢癌患者血清NO水平比較＊P＜0.01與對(duì)照組比較（t檢驗(yàn)）Figure 6 NO content in the blood of ovarian cancer patients and normal controls

3 討 論

BK是機(jī)體一種非常重要的促炎癥反應(yīng)9肽類物質(zhì)，是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的終末效應(yīng)物質(zhì)，其在組織損傷后介導(dǎo)多種炎癥和血管反應(yīng)。BK對(duì)機(jī)體的作用通過與BK受體（B1和B2受體）結(jié)合起效。B1和B2受體均為G蛋白偶聯(lián)受體。其中B1受體屬于誘導(dǎo)型受體，正常情況下幾乎不表達(dá)，炎癥等情況下表達(dá)量明顯增加，多種因素如生長(zhǎng)因子、促炎因子及受體激動(dòng)劑等均可促使B1受體的表達(dá)上調(diào)。B2受體在組織中固有表達(dá)。BK與其受體結(jié)合后可激活多種信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）和核因子 κB 通路［5-7］。其中PKC通道可通過激活細(xì)胞內(nèi)的第二信使（Ca2＋）導(dǎo)致 NO 產(chǎn)生增加［8-9］。

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌、胃癌和肝癌的腹腔滲液中BK水平高［10-13］，提示BK可能參與惡性腫瘤的發(fā)生，BK受體有望成為惡性腫瘤的治療靶位［9］。但目前對(duì)其亞型在腫瘤中的表達(dá)及各亞型所起的作用研究尚少，且結(jié)果也不一致［9，14］。因此，有必要深入研究BK各亞型及其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生及增殖中的作用。該研究有助于更好地了解腫瘤的發(fā)生和增殖機(jī)制，可為臨床更好的聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者血清中NO含量明顯高于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。NO是近年來在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的生物小分子物質(zhì)，可參與生物體內(nèi)細(xì)胞間的生物信號(hào)傳遞和許多生理、病理過程，特別是NO與腫瘤發(fā)生的關(guān)系成為近年來的研究熱點(diǎn)。在生物體內(nèi)左旋精氨酸在NOS的作用下與O2結(jié)合生成左旋胍氨酸和NO。催化此反應(yīng)的NOS有3種同功酶：存在于內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS，存在于巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞中的iNOS和存在于神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)型NOS。

在內(nèi)皮細(xì)胞中，B2受體的激活導(dǎo)致Gαq／11的活化，進(jìn)而激活Ca2＋-鈣調(diào)素依賴性eNOS的激活，使NO瞬時(shí)、小量的升高，而B1受體被激活后則可通過G蛋白αi亞單位，G蛋白β、γ亞單位和惡性腫瘤基因依賴性細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶／絲裂原活化蛋白激酶的激活導(dǎo)致iNOS的激活［15］。但這一信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中是否起作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究以上皮性卵巢癌或卵巢良性腫瘤的卵巢組織為標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察了BK受體的2個(gè)亞型（B1和B2受體）及產(chǎn)生其下游信號(hào)NO的eNOS和iNOS的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織細(xì)胞中B1和B2受體、eNOS和iNOS的表達(dá)均增加。提示，卵巢癌患者血清中NO的升高可能與BK激活其受體介導(dǎo)的信號(hào)通路（B1受體／eNOS和B2受體／iNOS）有關(guān)，但2個(gè)亞型所起的確切作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

腫瘤的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，隨著人們對(duì)腫瘤的深入研究，BK及其受體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用將逐漸被闡明。本研究結(jié)果顯示，BK受體特別是B2受體 在卵巢癌的發(fā)生中有非常重要的作用，所以B2受體拮抗劑有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，卵巢癌患者血清中NO水平明顯升高，且卵巢組織中B1和B2受體、eNOS及iNOS的表達(dá)都增加。

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