二惡英暴露對子宮內(nèi)膜異位癥模型形成的影響

崔照領(lǐng)，黃向華，宮心鵬

（1.河北省石家莊市第六醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊050091；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊050000）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是指子宮內(nèi)膜腺體或間質(zhì)出現(xiàn)在子宮以外的部位，具有浸潤性。近年來隨著環(huán)境污染的加重，EMs發(fā)病率逐漸增高，但其促發(fā)因素尚未闡明。研究表明二惡英與EMs的發(fā)病有密切關(guān)系，四氯二苯并-p-二惡英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）是環(huán)境毒物大家庭中毒性最強的一種，常以微小顆粒存在于大氣中，具有生物累積性，可促進EMs的發(fā)生及發(fā)展，并且隨暴露劑量的增高，EMs的發(fā)生、發(fā)展速度及程度逐漸加重［1］。有研究報道圍產(chǎn)期暴露于二惡英可能會促進成年期嚙齒類動物患EMs風(fēng)險［2］。并且胎兒期在二惡英持續(xù)暴露的環(huán)境下可能促進成年期EMs的發(fā)展。本研究旨在探討發(fā)育的不同時期，不同劑量的TCDD對小鼠不同部位EMs的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 成熟雌性無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級 C57BL／6小鼠60只（體質(zhì)量18～22g），成熟雄性SPF級C3H小鼠30只（體質(zhì)量20～24g），均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。2，3，7，8-TCDD為標準品（純度＞99%，ED-901-C，Cambridge Isotope Labe）。

1.2 實驗設(shè)計 將C57BL／6雌性小鼠60只與C3H雄性小鼠30只以2∶1隨機合籠交配，以見到陰道栓為受孕第0天，在受孕第8天將60只已孕母鼠隨機分為對照組（TCDD 0μg／kg）20只和暴露組（TCDD 3μg／kg）40，選擇雌性子鼠共60只，在原對照組中選擇24只，分為0和3μg TCDD／kg組；在原暴露組中選擇36只，分為0，3，10μgTCDD／kg組，每個處理組中12只子鼠，雌性子鼠在生后21d隨機分為5個處理組，分別為（生前／生后）：0／0、0／3、3／0、3／3、3／10組（即對照組、青春期＋成年期暴露組、胎兒期＋成年期暴露組、胎兒期＋青春期＋成年期普通劑量暴露組、胎兒期＋青春期＋成年期高劑量暴露組）。在生后49d每個處理組給予3μg／kg TCDD，于第70天給予3μg／kg TCDD，同時行自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)，并且于術(shù)后3、6、9周各暴露1次TCDD（3μg／kg），術(shù)后12周將動物脫臼處死。取其不同部位的種植異位灶，中性福爾馬林固定，石蠟包埋用于檢查。

1.3 染毒方式 灌胃強飼方法。

1.4 動物建模術(shù) 采用自體子宮內(nèi)膜移植法建立小鼠EMs模型。手術(shù)在無菌條件下進行，將一側(cè)子宮角分成3塊，分別縫合在小鼠卵巢、腹膜和腹部皮下，每塊約2mm×2mm。判斷建模成功的標準［3］：①肉眼觀，移植的子宮內(nèi)膜存活，移植物的體積增大，有血管形成，見內(nèi)含清亮液體的小囊泡；②鏡下觀，病理檢查見囊內(nèi)有子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞，其間可見大量炎性細胞浸潤。

1.5 異位病灶的形成和檢測 于建模術(shù)后12周處死小鼠，根據(jù)大體外觀和鏡下病理組織形態(tài)學(xué)鑒定子宮內(nèi)膜異位病灶的形成，并將異位種植物及其周圍粘連的組織取下，制成石蠟塊，HE組間染色，用于病理組織形態(tài)學(xué)的鑒定和評估。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠造模成功率比較 各組小鼠于造模術(shù)后12周處死，各組均能見到典型的異位病灶（圖1）。各組間皮下種植成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），腹膜和卵巢部位種植成功率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過組間兩兩比較結(jié)果顯示3／3組種植成功率顯著高于0／0組（P＜0.05）。見表1。

0／0組內(nèi)皮下、腹膜及卵巢異位種植成功率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。0／3組、3／0組、3／3組、3／10組內(nèi)不同部位的異位種植成功率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），0／3組、3／3組、3／10組卵巢的異位種植成功率顯著高于皮下（P＜0.05）。3／0組卵巢的異位種植成功率顯著高于皮下和腹膜（P＜0.05）。見表1。

2.2 種植成功異位灶肉眼觀 隨暴露劑量的增加異位灶外觀由小囊泡發(fā)展為大囊泡，內(nèi)有大量液體積聚，表面張力較大腹腔組織粘連嚴重，周圍臟器多有炎性充血表現(xiàn)（圖2）。

表1 不同組別小鼠子宮內(nèi)膜異位種植成功情況比較Table 1 The survivor rate of ectopic planations for endometrium among different groups（例數(shù)）

圖1 小鼠自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)后，建模成功的異位病灶組織，見到子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體（HE×400）Figure 1 Endometrial gland and stroma in ectopic tissues successfully established after autotrasplatation of endometrium of mouse（HE×400）

圖2 小鼠自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)后，建模成功典型的肉眼異位病灶，見大小不等水泡樣組織，腹腔粘連嚴重 （HE×400）Figure 2 Bubbles in the same organization vary in size and synechiaed severely of enterocoeliain successfully established after autotrasplatation of endometrium of mouse（HE×400）

3 討 論

研究表明EMs的患病率存在種族差異，國家和地區(qū)之間發(fā)病率明顯不同，使人們聯(lián)想到環(huán)境因素可能是促使EMs發(fā)病的因素。Eskenazi等［4］對意大利化學(xué)物質(zhì)TCDD意外泄漏事件中受害女性進行的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，接觸TCDD濃度越高的女性EMs發(fā)病的危險性越大，其患病率與環(huán)境TCDD的濃度呈正相關(guān)。TCDD可以增加患腹膜型及深部子宮內(nèi)膜異位結(jié)節(jié)的風(fēng)險［5］，并且圍產(chǎn)期暴露增加成年期患EMs的風(fēng)險。本研究通過建立小鼠EMs模型發(fā)現(xiàn)，胎兒期＋青春期＋成年期均暴露組的異位種植成功率顯著高于對照組，卵巢部位異位灶種植成功率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但其大體外觀如腹腔粘連程度較其他處理組明顯嚴重，異位灶的累及范圍較其他處理組廣泛。說明TCDD可能促進子宮內(nèi)膜的異位種植，并且高劑量暴露組明顯促進子宮內(nèi)膜異位病灶的種植及生長。

本研究結(jié)果顯示，TCDD暴露組卵巢部位子宮內(nèi)膜種植成功率顯著高于皮下，而前者為種植于腹腔深部組織，并且3／3組及高劑量組卵巢部位種植成功率明顯高于其他組。說明TCDD的持續(xù)暴露促進EMs的發(fā)生及發(fā)展。深部浸潤型EMs患者體內(nèi)脂肪組織中TCDD含量較高［6］，由于TCDD具有生物累積及脂肪聚積性，因此脂肪組織較多的患者是否體內(nèi)存在EMs的易感性基因，值得我們深思。但本研究中小鼠的子宮內(nèi)膜組織種植于皮下的成功率較低。是否與皮下脂肪較少有關(guān)，尚需進一步研究。

研究表明遺傳因素在EMs發(fā)病的病因?qū)W中起重要作用，環(huán)境因素與遺傳因素的相互作用具有密切關(guān)系［7］。越來越多的證據(jù)表明EMs作為一個復(fù)雜的特征具有遺傳性，多基因遺傳易感性產(chǎn)生的顯型與環(huán)境因子有關(guān)［8］。但在有或無EMs婦女的子宮內(nèi)膜芳香烴受體和二惡英相關(guān)基因的表達并沒用不同，TCDD的持續(xù)性暴露可能會改變基因的高表達［9］。研究發(fā)現(xiàn)，TCDD含量高的地區(qū)其EMs患病人群比例偏高，上調(diào)二惡英相關(guān)基因CYP1A1的表達促進EMs的發(fā)生及發(fā)展［10］。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠宮內(nèi)及宮外聯(lián)合并且持續(xù)暴露TCDD，EMs的發(fā)生率及嚴重程度高于其他組，并且高劑量暴露組加重腹腔粘連嚴重程度。由此推理子宮內(nèi)膜患病人群是否存在二惡英相關(guān)的易感基因，通過某種途徑改變子宮內(nèi)膜的性狀，從而使得成年期發(fā)病率升高。這也說明為什么不同地區(qū)其發(fā)病率不同，為我們后續(xù)研究提供了新的思路，也為臨床尋求有效治療EMs的方法拓寬視野。

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