鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)及抗病力的影響?

王艷龍， 徐 瑋， 汪東風(fēng)， 韓麗蓉， 白 陽

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

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鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)及抗病力的影響?

王艷龍， 徐 瑋??， 汪東風(fēng)， 韓麗蓉， 白 陽

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

為研究稀土元素鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)及抗病力的影響，本文在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量鑭，制備了5種實(shí)驗(yàn)飼料，飼料中鑭的濃度分別為0、10、25、50和75mg/kg。以初始體重(6.72±0.01)g的仿刺參(ApostichopusjaponicasSelenka)為研究對(duì)象，用制備的飼料在室內(nèi)進(jìn)行8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)刺參進(jìn)行稱重，計(jì)算特定生長(zhǎng)率，隨機(jī)選取4頭解剖取樣，測(cè)定刺參體腔液的相關(guān)免疫酶活性，剩余刺參通過腹腔注射刺參腐皮綜合癥致病菌燦爛弧菌(Vibriosplendidus)進(jìn)行14d的攻毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明：與對(duì)照組相比，飼料中添加50mg/kg處理組的特定生長(zhǎng)率提高了36.92%；當(dāng)飼料中稀土元素鑭添加量為50mg/kg時(shí)，刺參體腔細(xì)胞吞噬活性、呼吸爆發(fā)活力、酸性磷酸酶(ACP)活性和堿性磷酸酶(AKP)活性顯著高于對(duì)照組；當(dāng)飼料中鑭添加量為10～50mg/kg時(shí)，刺參體腔細(xì)胞總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總一氧化氮合酶(T-NOS)活性有升高的趨勢(shì)，但是沒有顯著性差異；攻毒實(shí)驗(yàn)顯示，50mg/kg處理組的刺參累計(jì)發(fā)病率顯著低于對(duì)照組。研究表明，飼料中添加50mg/kg的稀土元素鑭可以促進(jìn)刺參生長(zhǎng)，同時(shí)可以提高刺參的非特異性免疫酶活性。

刺參；鑭；生長(zhǎng)；免疫反應(yīng)；抗病力

仿刺參(ApostichopusjaponicasSelenka)又稱刺參，隸屬于棘皮動(dòng)物門(Echinodermate)。在中國(guó)海域分布有140多種，其中以黃、渤海刺參品質(zhì)最佳。刺參體壁富含膠原蛋白、活性多糖和礦質(zhì)元素等，具有很高的食用和藥用價(jià)值，近年來，已經(jīng)成為中國(guó)北方水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)物種，但是快速擴(kuò)大養(yǎng)殖和集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致了刺參感染性疾病爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，用于防治病害的方式主要是使用抗生素和免疫增強(qiáng)劑，因?yàn)榭股氐氖褂脮?huì)帶來刺參抗藥性、藥物殘留、污染環(huán)境等問題，因此免疫增強(qiáng)劑的研究正逐漸成為熱點(diǎn)。

稀土元素(Rare Earth Elements, REE)包括鑭系元素和電子結(jié)構(gòu)相似的鈧和釔，共有17種，其中鑭、鈰是目前研究相對(duì)較多的輕稀土。已有研究表明，飼料中添加鑭系稀土具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、增強(qiáng)抗病力等生理作用，稀土在農(nóng)作物、畜禽和漁業(yè)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用[1-4]。稀土離子通過與細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜結(jié)合影響膜上有關(guān)酶的活性或改變膜的通透性，進(jìn)而對(duì)第二信使產(chǎn)生作用引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的信息傳遞系統(tǒng)，引起相關(guān)基因的差異表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列生理、生化變化，產(chǎn)生“低促高抑”的生物效應(yīng)，即Hormesis效應(yīng)[5]。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討海參基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)和抗病力的影響，以期為稀土元素鑭在棘皮動(dòng)物配合飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以馬尾藻粉、魚粉、小麥粉和豆粕等為基礎(chǔ)原料，配制粗蛋白和粗脂肪含量分別為18.6%和1.1%的基礎(chǔ)飼料(見表1)。分別在每千克基礎(chǔ)飼料中添加0、10、25、50和75 mg鑭配制出5種實(shí)驗(yàn)飼料。原料均粉碎過100目篩，按配比定量后混勻，然后加入適量水揉勻，經(jīng)雙螺旋桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué)研制的F-II(26)型)擠壓出直徑為1mm的顆粒，在鼓風(fēng)干燥箱中48 ℃烘干，烘干的飼料粉碎后，篩選40～80目顆粒貯存于-20 ℃冰箱待用。硝酸鑭(La(NO3)3)購自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，經(jīng)ICP-OES(VISTA-MPX，VARIAN)測(cè)得硝酸鑭中鑭含量為39.34%。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

實(shí)驗(yàn)用刺參苗購于山東省青島市田橫商業(yè)育苗場(chǎng)同一批培育的稚參。刺參在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間飽食投喂實(shí)驗(yàn)對(duì)照組飼料，水溫控制在16 ℃。分苗前，刺參饑餓24 h稱重計(jì)數(shù)，挑選個(gè)體大小均勻的健康刺參分配到室內(nèi)20個(gè)60 L玻璃缸中。隨機(jī)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)17頭刺參，實(shí)驗(yàn)刺參的初始平均體重為(6.72±0.01)g。飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，控制水溫(16±0.5)℃，鹽度30～31，pH 7.8～8.2，溶氧不低于5 mg/L，氨氮不高于0.5 mg/L，亞硝氮不高于1 mg/L。每天根據(jù)刺參攝食情況適當(dāng)調(diào)整投餌量以達(dá)到飽食投喂，投喂量為刺參體重4%～7%，投喂時(shí)間為17：00，次日8：00清理殘餌和糞便，更換1/3新鮮海水，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。

表1 基礎(chǔ)飼料配方(按干物質(zhì)計(jì))

注：1 秘魯紅魚粉購于青島七好生物科技有限公司；2 馬尾藻粉購于山東威海金牌飼料有限公司；3 豆粕、啤酒酵母、小麥粉和大豆卵凝脂購于山東六合飼料有限公司；4 復(fù)合維生素和復(fù)合礦物鹽由青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司友情提供；5 維生素混合物(mg/kg飼料)：鹽酸硫胺素90；核黃素150；鹽酸吡哆醇210；維生素B12 0.03；甲萘醌50；肌醇600；泛酸鈣150；尼克酸600；葉酸15；生物素1.20；醋酸視黃醇32；維生素D3 12；維生素E 120；乙氧基喹啉150；6 礦物質(zhì)混合物(mg/kg 飼料)：碘化鉀0.8；六水氯化鈷(1%) 40；五水硫酸銅100；七水硫酸亞鐵450；一水硫酸鋅250; 一水硫酸錳60；七水硫酸鎂4000。

Note： 1 Purchased from Qingdao Great Seven Biotechnology Co., Ltd.; 2 Purchased from Shandong Jinpai Feed Co. Ltd, China; 3 Purchased from Shandong Liuhe Group Co., Ltd., China; 4 Kindly provided by Qingdao Master Biotechnology Co., Ltd., China; 5 Vitamin premix (mg/kg diet): thiamin 90; riboflavin 150mg; pyridoxine HCl 210; vitamin B12 0.03; vitamin K350; inositol 600; Calcium pantothenate 150; niacin acid 600; folic acid 15; biotin 1.20; retinol acetate 32; cholecalciferol 12; a-tocopherol 120; ethoxyquin 150; 6 Mineral premix (mg/kg diet): KI 0.8; CoCl2·6H2O (1%) 40; CuSO4·5H2O 100; FeSO4·7H2O 450; ZnSO4·H2O 250; MnSO4·H2O 60; MgSO4·7H2O 4000.

1.3 樣品采集及處理

8周養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)刺參饑餓24 h，然后稱重、計(jì)數(shù)。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4頭刺參，解剖吸取體腔液測(cè)定免疫指標(biāo)，剩余刺參用于攻毒試驗(yàn)。

刺參體腔液的采集參考趙彥翠[6]的方法，并作適當(dāng)改進(jìn)。按體腔液與抗凝劑(0.02 mol/L EGTA，0.048 mol/L NaCl，0.019 mol/L KCl，0.068 mol/L Tris-HCl，pH=7.6)體積比1∶1混合均勻，即抗凝體腔液。一部分抗凝體腔液用于體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)、吞噬活性和呼吸爆發(fā)活性測(cè)定；另一部分抗凝體腔液離心10 min(3000×g，4 ℃)后，棄上清，收集的體腔細(xì)胞沉淀用等體積預(yù)冷PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)重新懸浮。懸液用超聲波細(xì)胞破碎儀(22 kHz，25×6 s，0 ℃)破碎后，離心10 min(4000×g，4 ℃)，所得上清液即體腔細(xì)胞破碎上清液(CLS)，CLS用于總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、總一氧化氮合酶(T-NOS)活力、酸性磷酸酶(ACP)活力和堿性磷酸酶(AKP)活力測(cè)定。

1.4 攻毒試驗(yàn)

取樣剩余13頭刺參用于攻毒試驗(yàn)，所用燦爛弧菌(Vibriosplendidus)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所提供。燦爛弧菌用LB固體培養(yǎng)基活化(28 ℃，24 h)，然后接種到LB液體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h用PBS緩沖液稀釋到濃度為1×109CFU/mL(通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到刺參7d的半致死濃度LD50為1×108CFU/mL)。每頭刺參通過腹腔注射0.1 mL燦爛弧菌活菌液，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組刺參分別繼續(xù)投喂對(duì)應(yīng)的飼料，記錄14 d內(nèi)刺參的發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)累積發(fā)病率。

1.5 樣品分析測(cè)定方法

1.5.1 刺參特定生長(zhǎng)率 特定生長(zhǎng)率計(jì)算公式如下：特定生長(zhǎng)率SGR(%/d)=(lnWt-lnWo)×100%/t式中：Wo和Wt分別為刺參的初始體重和終末體重(g)；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.5.2 刺參體腔細(xì)胞密度 將50 μL抗凝體腔液加入到150 μL戊二醛固定液中，用血球計(jì)數(shù)板在10×40倍顯微鏡下直接進(jìn)行體腔細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出刺參體腔液的細(xì)胞密度。

1.5.3 體腔細(xì)胞吞噬活性 刺參體腔細(xì)胞的吞噬活性采用吞噬中性紅的方法進(jìn)行測(cè)定[6]，略有改動(dòng)。取100 μL抗凝體腔液加入到96微孔板中，讓體腔細(xì)胞貼壁30 min后，棄上清，然后加入0.03%中性紅100 μL，室溫靜置30 min后，用PBS緩沖液洗去未被體腔細(xì)胞吞噬的中性紅。最后加入100 μL細(xì)胞裂解液(冰乙酸∶無水乙醇=1∶1)裂解20 min，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀540 nm下測(cè)定吸光值(OD540)，結(jié)果以每106個(gè)體腔細(xì)胞的吸光值表示刺參體腔細(xì)胞吞噬活性高低。

1.5.4 體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力 參考趙彥翠[6]的方法并作適當(dāng)改動(dòng)，預(yù)先在96微孔板中加入50 μL 0.2%多聚賴氨酸(poly-D-lysine，Sigma)，然后加入200 μL抗凝體腔液離心10 min(300×g，4 ℃)，去除上清，然后加入100 μL(1 μg/mL)PMA(Phorbol myristate acetate, Sigma)，溫育30 min(37 ℃)，然后加入100 μL 0.3%NBT(Nitroblue tetrazolium, Sigma)，在37 ℃下溫育30 min后，離心10 min(560×g，4 ℃)，去除上清后加入200 μL 100%甲醇終止反應(yīng)10 min，離心10 min(700×g，4 ℃)，去除上清，再用70%甲醇反復(fù)洗滌3次，離心去上清，于室溫下晾干。干燥后加入120 μL 2 mol/L KOH和140 μL DMSO(二甲基亞砜)，靜置20 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm下的吸光值(OD630)，刺參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力以每106個(gè)體腔細(xì)胞的吸光值表示。

1.5.5 CLS中總超氧化物歧化酶(T-SOD)的測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒測(cè)定，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。CLS中SOD酶活力單位定義為每毫克樣品蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)活力單位(U)，SOD活力表示為U/mg蛋白。

1.5.6 CLS中總一氧化氮合酶(T-NOS)的測(cè)定 使用南京建成NOS測(cè)定試劑盒，利用NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)吸光度大小計(jì)算NOS活力。以每毫克樣品蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個(gè)酶活力單位(U)，NOS活性表示為U/mg蛋白。

1.5.7 CLS中酸性磷酸酶(ACP)的測(cè)定 采用南京建成ACP測(cè)定試劑盒，酸性磷酸酶分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺測(cè)定酶活力。以每克樣品蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用30min產(chǎn)生1 mg酚為一個(gè)活力單位(U)，ACP活性表示為U/g蛋白。

1.5.8 CLS中堿性磷酸酶(AKP)的測(cè)定 按照南京建成AKP測(cè)定試劑盒的操作手冊(cè)，定義每克樣品蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1 mg酚為一個(gè)金氏單位，AKP活力表示為金氏單位/g蛋白。

1.5.9 體腔細(xì)胞蛋白含量的測(cè)定 采用Bradford方法通過考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行測(cè)定，以小牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。并用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行顯色，反應(yīng)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)體系在595 nm下吸光值。

1.5.10 刺參累計(jì)發(fā)病率 累計(jì)發(fā)病率計(jì)算公式如下：

累計(jì)發(fā)病率(Cumulative mortality)=DT/D0×100%,

式中：D0和DT分別為攻毒過程中刺參初始頭數(shù)和累計(jì)發(fā)病頭數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 稀土鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)影響

飼料中添加稀土鑭能不同程度促進(jìn)刺參生長(zhǎng)，當(dāng)飼料中鑭的添加量為50 mg/kg時(shí)，刺參終末平均體重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，特定生長(zhǎng)率為1.235%/d，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，10和75 mg/kg鑭處理組(SGR)與對(duì)照組相比沒有顯著性差異(P>0.05,見表2)。

表2 飼料中添加稀土鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4)1

注：1.表中所給數(shù)據(jù)位為平均值及4個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤；2.ANOVA表示單因素方差；3.數(shù)值的不同上標(biāo)表示組間有顯著性差異(P<0.05)。

Notes: 1.Values are means and standard errors of four replicates. 2. ANOVA: One-way analysis of variance. 3. Means in the same column with different superscript letters are significantly different (P<0.05).

2.2 稀土鑭對(duì)刺參免疫反應(yīng)影響

與對(duì)照組相比，飼料中添加鑭能不同程度提高刺參體腔細(xì)胞吞噬活性、呼吸爆發(fā)活性、T-SOD、NOS、ACP及AKP活性(見表3)。其中25 mg/kg鑭添加組和50 mg/kg鑭添加組的吞噬活性顯著高于其它組(P<0.05)，其它各處理組間沒有顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)鑭添加量為50 mg/kg時(shí)，刺參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性、T-SOD活性、ACP及AKP活性顯著高于其它組(P<0.05)；刺參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性、T-SOD活性、ACP活性及AKP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，雖然其它組與對(duì)照組相比，刺參體腔細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性和體腔液細(xì)胞ACP和AKP活性有所提高，但是沒有顯著性差異(P>0.05)，75 mg/kg鑭添加組的T-SOD活性低于對(duì)照組(P>0.05)。當(dāng)飼料中添加25 mg/kg鑭時(shí)，刺參體腔液NOS活性高于其它組，但是各組間沒有顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料中鑭的添加量的升高，刺參體腔液的ACP活性有下降趨勢(shì)。

表3 飼料中添加稀土鑭對(duì)刺參免疫指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4)1

注：1.表中數(shù)據(jù)均為平均數(shù)及4個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤；2.ANONA表示單因素方差分析；3.數(shù)值的不同上標(biāo)表示組間有顯著性差異(P<0.05)。

Notes: 1.Values is means and standard errors of four replicates. 2. ANOVA: One-way analysis of variance. 3. Means in the same column with different superscript letters are significantly different (P<0.05).

2.3 稀土鑭對(duì)刺參抗弧菌感染能力影響

經(jīng)過14 d燦爛弧菌攻毒試驗(yàn)后結(jié)果(見圖1)，對(duì)照組的刺參累計(jì)發(fā)病率為58.46%，飼料中鑭添加量為50 mg/kg時(shí)刺參累計(jì)發(fā)病率為36.54%，顯著低于其它組(P<0.05)。10和25 mg/kg鑭添加量處理組的刺參發(fā)病率均低于對(duì)照組，但是沒有顯著性差異(P>0.05)。

3 分析與討論

3.1 稀土鑭對(duì)刺參生長(zhǎng)的影響

已有研究表明在陸地動(dòng)物和水產(chǎn)動(dòng)物(魚、蝦和貝等)的飼料中添加稀土元素，能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[7-8]。稀土元素鑭是稀土中的主要元素之一，鑭能夠促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，例如劉穎[9]發(fā)現(xiàn)，低劑量La(NO3)3有促進(jìn)大鼠體重增長(zhǎng)和肝糖原合成的趨勢(shì)，而高劑量時(shí)(200 mg/kg)則有抑制作用。朱伯清[10]等發(fā)現(xiàn)，飼料中添加30～200 mg/kg的稀土，可以促進(jìn)中國(guó)東方對(duì)蝦的生長(zhǎng)，且當(dāng)稀土添加量為60 mg/kg時(shí)，效果最好。王敏奇等[11]研究結(jié)果顯示，添加鑭使豬的日增重、飼料轉(zhuǎn)化效率分別提高了13.06%(P<0.05)和6.53%(P<0.05)。鄭宗云等[12]在斷奶仔豬的基礎(chǔ)日糧中添加富含鑭、鈰的稀土硝酸鹽，結(jié)果表明，添加量為600 mg/kg時(shí)仔豬的日增重提高了28.1%。在本研究中，飼料中添加稀土元素鑭為50 mg/kg時(shí)能顯著促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)，對(duì)于稀土元素促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的機(jī)制尚不確定。一種解釋認(rèn)為稀土離子能夠通過與細(xì)胞器和細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，參與或調(diào)節(jié)Ca2+的代謝，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，Ca2+的濃度變化調(diào)節(jié)著細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞分裂等一系列生理生化反應(yīng)[13]。

(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=4。不同字母表示4個(gè)處理間有顯著差異(P<0.05)。Means ± S.E.,n=4. Different letters indicate significant (P<0.05) difference in mean accumulative morbidity among four treatments.)

圖1 燦爛弧菌攻毒后刺參的累計(jì)發(fā)病率

Fig.1 Accumulative morbidity ofApostichopusjaponicas數(shù)據(jù)的福建海域Selenka after being challenged byV.splendidus

3.2 稀土鑭對(duì)刺參免疫力的影響

與其它無脊柱動(dòng)物相比，刺參的特異性免疫系統(tǒng)很不完善，但具有較為完善的非特異性免疫系統(tǒng)，其中對(duì)抗病原的吞噬細(xì)胞和細(xì)胞因子起主導(dǎo)作用。吞噬作用是機(jī)體內(nèi)部防御的第一道防線，吞噬細(xì)胞可以對(duì)外源粒子進(jìn)行黏附、吞噬和降解[14]。體腔吞噬細(xì)胞吞噬病原的同時(shí)會(huì)釋放細(xì)胞活性氧(ROIs)，其中細(xì)胞超氧陰離子(O2-)是棘皮動(dòng)物的體腔細(xì)胞在吞噬侵入體內(nèi)的病原微生物時(shí)產(chǎn)生的最先產(chǎn)物，因此細(xì)胞內(nèi)O2-濃度被認(rèn)為是定量呼吸爆發(fā)活性大小的一個(gè)指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)稀土元素鑭在飼料中添加量為50 mg/kg時(shí)吞噬活性和呼吸爆發(fā)活性高于其它組，結(jié)果表明稀土元素鑭有效激活刺參吞噬細(xì)胞的吞噬功能，從而改善和提高其非特異性免疫力。王宗惠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在4～125 μg/mL劑量范圍內(nèi)，稀土能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞特異吞噬功能，并呈劑量反應(yīng)依賴關(guān)系。崔麗卿等[17]研究表明飼料中添加稀土元素能提高大菱鲆血液中性粒細(xì)胞的吞噬活性。而有關(guān)稀土提高吞噬指數(shù)的機(jī)理，Mizgerd等[18]的研究表明，稀土能夠被巨噬細(xì)胞所吞噬從而促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類之一，SOD能夠清除吞噬過程產(chǎn)生的高濃度O2-及生化過程中產(chǎn)生的氧自由基[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加50 mg/kg稀土元素鑭能顯著提高刺參體腔液總SOD活性。劉潔等[20]研究發(fā)現(xiàn)低濃度Ce3+溶液處理大鼠紅血球SOD時(shí)，SOD的α-螺旋含量增加，β-折疊含量減小，SOD活性升高；高濃度Ce3+處理SOD時(shí)，SOD活性下降。Y.Chen等[21]研究表明，用一定濃度La3+、Gd3+和Y3+浸浴處理金魚18 d，金魚肝臟SOD酶活分別提高了15.58%、16.80%和24.80%。

一氧化氮合酶(NOS)是生物體非特異性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在病原體(細(xì)菌、病毒和寄生蟲)、細(xì)胞因子(IFN、IL、TNF)、免疫刺激物(LPS，酵母聚糖)等的作用下，iNOS被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，NO自由基通過刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)受感染細(xì)胞的炎癥和死亡，起到對(duì)抗外援微生物的細(xì)胞毒作用[22]。堿性磷酸酶(AKP)在生物體組織內(nèi)廣泛存在，是一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境下(最適pH為10左右)可以催化各種醇和酚的磷酸酯進(jìn)行水解反應(yīng)。與之相對(duì)應(yīng)的是酸性磷酸酶(ACP)，一般認(rèn)為ACP主要存在于吞噬細(xì)胞，位于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標(biāo)志酶[23]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)飼料中添加50 mg/kg稀土元素鑭時(shí)，刺參體腔液的ACP和AKP活性明顯提高，NOS活性沒有明顯變化，隨著鑭元素濃度升高ACP和NOS活性有下降趨勢(shì)。夏青[24]等研究發(fā)現(xiàn)，用20 mg/kg常樂稀土溶液連續(xù)灌胃大鼠，3個(gè)月后大鼠血清中ALP活性顯著升高。有研究證實(shí)，硝酸鑭對(duì)離體動(dòng)物細(xì)胞外源性刺激表現(xiàn)出低劑量促進(jìn)，高劑量抑制免疫功能作用[25-27]。

3.3 稀土鑭對(duì)刺參抗病力的影響

刺參抗病力大小是免疫增強(qiáng)劑作用效果的直觀體現(xiàn)，燦爛弧菌是刺參發(fā)生腐皮綜合癥的致病菌，對(duì)刺參養(yǎng)殖危害嚴(yán)重。大量研究表明稀土離子有一定的抗菌作用[28-31]，同時(shí)可以提高水產(chǎn)動(dòng)物成活率。本研究中，飼料中鑭添加量為50 mg/kg時(shí)能顯著降低刺參的累計(jì)發(fā)病率，這種抗病力的提升與刺參體腔液中吞噬細(xì)胞活性、SOD、ACP和AKP酶活性的提高有關(guān)。另外，刺參抗病力大小與鑭添加劑量有關(guān)，高劑量稀土元素鑭對(duì)刺參抗病力影響不大。

4 結(jié)語

在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)飼料中鑭的添加量為50mg/kg時(shí)，可顯著提高刺參的特定生長(zhǎng)率同時(shí)提高刺參的非特異性免疫酶活性。表明飼料中添加適當(dāng)濃度稀土鑭具有促進(jìn)刺參生長(zhǎng)，提高免疫反應(yīng)和抗病力生理作用。然而更高水平的鑭添加量對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫及抗病力影響以及稀土元素鑭在刺參機(jī)體內(nèi)的代謝還有待于進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Effects of Dietary La3+on Growth, Immunity and Disease Resistance toVibriosplendidusof Sea Cucumber,Apostichopusjaponicas

WANG Yan-Long, XU Wei, WANG Dong-Feng, HAN Li-Rong, BAI Yang

(College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A 8-week feeding experiment was conducted to evaluate the effects of La3+on the sea cucumber(initial average weight (6.72±0.01)g). Five practical diets were formulated with graded level of La3+(0, 10, 25, 50 and 75mg/kg dry feed). At the end of the feeding experiment, sea cucumbers were weighed by tank to monitor growth.Four sea cucumbers were randomly collected for the assay of immune parameters.The remaining juveniles were injected with the pathogen bacteriaV.Splendidusand monitor the accumulative mortality rate during 14 d. The experiment result indicated that the specific growth rate of 50 mg/kg La3+group was 36.92% higher than the control group. Compare to the control,sea cucumbers fed with 50mg/kg La3+had significant higher activities of phagocytosis, respiratory burst, acid phosphatase (ACP) andalkaline phosphatase (AKP). The activity of total superoxide dismutase(T-SOD) and total nitric oxide synthase(T-NOS) of coelomocytes was tending to increase as dietary La3+increased from 10 to 50mg/kg, but there were no significant differences. The result of challenge test also showed that sea cucumbers fed with 50mg/kg La3+had significantly lower accumulative mortality compared with the control groups. In conclusion, the oral administration of La3+on the sea cucumber at a dose of 50 mg/kg can improve growth, enhance the immunity as well as increase disease resistance.

sea cucumber; La3+; growth; immune response; disease resistance

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371731)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2009DM026)資助

2014-08-11；

2014-10-13

王艷龍(1989-)，男，碩士生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail:wyl_189@126.com

?? 通訊作者： E-mail:weixu@ouc.edu.cn

S968.9

A

1672-5174(2015)09-054-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140246