2種多溴聯苯醚(BDE-47、BDE-209)對褶皺臂尾輪蟲單一和聯合毒性效應研究?

沙婧婧， 王 悠， 王 鴻， 陳 悅2， 李曉紅， 徐寧寧， 唐學璽??

(1. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012)

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2種多溴聯苯醚(BDE-47、BDE-209)對褶皺臂尾輪蟲單一和聯合毒性效應研究?

沙婧婧1， 王 悠1， 王 鴻1， 陳 悅2， 李曉紅1， 徐寧寧1， 唐學璽1??

(1. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012)

為豐富海洋環境中多溴聯苯醚污染對浮游動物毒性效應的研究，本文采用不同濃度的2種多溴聯苯醚BDE-47和BDE-209作為脅迫因子，以褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)為受試生物，研究其單一及聯合急性毒性效應。研究顯示：單一急性毒性作用時，BDE-47脅迫對輪蟲的48、72和96hLC50分別為2.113、0.376、0.163mg/L，均小于BDE-209各相應的LC50值，分別為11.162、1.237、0.295mg/L，說明BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性大于BDE-209；二者聯合作用時，分別采用濃度1∶1和毒性1∶1進行試驗，應用Marking相加指數法計算AI(Additive index)，評價二者對輪蟲的聯合毒性，2種試驗配比方式得到的結果類似，暴露時間分別為24、48h時AI>0，聯合作用結果均為協同作用；72、96h時AI<0，均表現為拮抗作用。結果表明，96h內隨著暴露時間的增加，BDE-47和BDE-209對其聯合毒性作用從協同作用轉變為輕微的拮抗作用。

BDE-47；BDE-209；褶皺臂尾輪蟲；急性毒性；聯合毒性

多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是一類新型的持久性有機污染物，根據溴原子在苯環上的個數和位置不同，共有209種同系物[1]。PBDEs作為阻燃劑，被廣泛應用于石油、塑料、紡織品、家用電器等領域[2]。多溴聯苯醚具有高親脂性和生物積累性，能夠通過食物鏈逐級放大，對動物及人類健康構成威脅。隨著全球消耗量的不斷增加，大量PBDEs通過各種途徑最終進入海洋，使海洋環境中的PBDEs濃度急劇上升。因此，近年來世界各國政府和研究者對PBDEs特別是其對海洋環境污染方面的關注日益增多[3]。

在PBDEs中，2,2′,4,4′-四溴聯苯醚(BDE-47)是在動物和人體組織中含量最高、對生物和人體毒性較強的同系物之一[4]。研究表明，生物對BDE-47的吸收速率大于其他的多溴聯苯醚[5]。BDE-47是海洋生物體內含量最高的PBDEs同系物[6]。十溴聯苯醚(BDE-209)揮發性低、脂溶性高，且具有環境穩定性。目前在生存環境中，其含量遠高于其他類型的PBDEs。BDE-209在我國海域分布較為廣泛，其中珠江三角洲及南海沿岸的生物受BDE-209污染程度已相當于或略高于世界范圍內其他的河口地區[7-11]。進入生物體的BDE-209可在相關酶的介導下進行代謝，代謝產物主要有低溴代的多溴聯苯醚、甲氧基取代的多溴聯苯醚(MeO-BDE)以及羥基取代的多溴聯苯醚(OH-BDEs)等[12]。BDE-209本身的毒性不高，但其代謝產物的毒性遠大于其本身[13]。BDE-209作為目前唯一仍在全球范圍內廣泛使用的多溴聯苯醚阻燃劑，其環境行為和生物效應已逐漸成為生態毒理領域的研究熱點[14]。

環境中的生物體通常暴露于多組分污染物共存的混合體系而非簡單的單一體系。目前，人們對于許多污染物的單一毒性已有了解，然而對于環境中實際存在的多種污染物的聯合毒性作用及其機理的研究還很有限，且由于聯合毒性實驗的復雜性，研究進展較為緩慢。多種污染物共同作用于生物體時，在機體可呈現復雜的交互作用，往往會引起與單一毒物作用完全不同的毒性反應，因此，研究毒物聯合作用的生物學效應，并將此應用于指導混合污染物的危險性評價具有重要意義[15]。

褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)是浮游動物的重要種類之一，廣泛分布于淡水及海水水域中。它易培養、繁殖快、大小適宜、營養豐富，是理想的生物餌料[16]。此外，其對毒性物質敏感，是毒理試驗中一種較為理想的受試動物[17]。關于污染物對輪蟲的毒性效應有過較多的報道，但海洋生物體內含量最高的低溴代BDE-47和海洋環境中廣泛存在的高溴代BDE-209對輪蟲的聯合毒性效應研究尚未見諸報道。本文針對多溴聯苯醚難溶于水的特性，采用二甲亞砜作為助溶劑進行毒性實驗，并對PBDEs的實際溶解濃度進行測定，研究了不同濃度的2種具有典型代表性的多溴聯苯醚(BDE-47、BDE-209)對褶皺臂尾輪蟲的單一急性毒性和聯合毒性效應，旨在豐富海洋中PBDEs污染對浮游動物毒性效應的研究內容，為海洋環境和生物資源保護提供基礎資料和理論依據，并為最終篩選出可用于PBDEs污染評價的敏感指標提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 餌料微藻的培養 餌料為自養小球藻(Chlorellaautotrophica)，由中國科學院海洋研究所提供。采用f/2培養液培養[18]。培養溫度為(20±1)℃，鹽度30±1，光照強度60μmol photons·m-2·s-1，光暗周期12h∶12h。每天定時搖動培養瓶3次，防止微藻附壁生長和下沉。

1.1.2 實驗動物的預培養 受試生物為褶皺臂尾輪蟲，由中國海洋大學水產學院提供的休眠卵孵化。挑選活潑健壯攜非混交卵雌體，在實驗室智能光照培養箱(GXZ型，江南儀器，寧波，中國)內培養2個月待用。培養條件：溫度(25±1)℃，光照60μmol·m-2·s-1，鹽度30±1。海水小球藻的投喂密度為1.0×106cells/mL。400mL的燒杯為培養容器，培養液體積200mL。馴化培養時輪蟲接種密度為10只/mL，預培養48h。取活潑健壯攜非混交卵雌體置入另外同樣條件的燒杯中培養，觀察卵的孵出情況，取2h內孵出的幼體為實驗材料開展后續實驗。

1.1.3 主要試劑及配制 實驗用海水經沉淀，0.45μm濾膜過濾，121.3℃滅菌20min，冷卻后使用。BDE-47全稱2,2′,4,4′-Tetrabromodiphenyl ether，化學式為C12H6Br4O，分子量是485.8，為美國AccuStandard公司生產的白色粉末狀固體產品，純度為100%。BDE-209全稱Decabromodiphenyl ether(GC/MS級)，化學式為C12Br10O，分子量是959.2，為德國Dr. Ehrenstorfer實驗室生產的白色粉末狀固體，純度為99.5%。由于多溴聯苯醚在海水中溶解度極低，故以二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑。本實驗所采用的DMSO為Sigma-Aldrich公司生產，GC級，純度≥99.0%。

試劑母液的配制：將50mg BDE-47溶于DMSO，25mL棕色容量瓶定容，配制成濃度為2×103mg·L-1的BDE-47母液。將100mg BDE-209溶于DMSO，50mL容量瓶定容，配制成濃度為2×103mg·L-1的母液。4℃下避光保存待用。實驗時，用過濾海水依次稀釋成設定的實驗濃度梯度。

1.2 助溶劑無明顯效應濃度值(No observed effect concentration，NOEC)測定

采用等比級數法，以4.9%、6.5%、8.7%、10%、12%、16%(v/v)的DMSO設置實驗梯度，每個濃度設置3個重復。實驗以不加入DMSO的一組為空白對照組。試驗在24孔加蓋培養板中進行，每孔放入10只活潑健壯的輪蟲幼體(蟲齡<2h)，并注入不同濃度的DMSO-海水溶液1mL。在溫度(25±1)℃的恒溫培養箱中進行，培養板加蓋，留縫隙，每12h懸浮沉積于孔底部的藻類餌料，每24h更換50%測試液，并投喂1.0×106cells/mL的小球藻餌料。每隔24h用解剖鏡觀察輪蟲的存活情況并計數。輪蟲死亡的判定方法依據美國實驗材料學會(ASTM，American Society of Testing Materials)制定的輪蟲急性毒性試驗標準指南[19]，即以輪蟲纖毛和體內運動停止、內部組織皺縮、輪盤縮回作為判定死亡的標準，若質疑其是否死亡，再觀察5s，如果咀嚼囊和足的活動停止，則視為死亡。得出死亡率，運用概率單位法計算DMSO對褶皺臂尾輪蟲的96h-NOEC值(死亡率≤10%時對應的濃度值)。

1.3 急性毒性實驗

根據助溶劑DMSO對褶皺臂尾輪蟲的NOEC值測定結果配制BDE-DMSO-海水溶液。根據24、48、72、96h預實驗結果進行PBDEs濃度梯度設置，分別設置6～8個濃度，BDE-47和BDE-209最高濃度均分別達到其在海水中的最高溶解度，每個濃度梯度設置3個重復，另設海水空白對照和助溶劑DMSO對照，助溶劑對照組中DMSO的含量與最高濃度組中DMSO的體積比濃度相同。在相應的孔中添加1mL配制好的各濃度BDE-DMSO-海水溶液。其它培養條件、輪蟲死亡判定標準及計數方法同1.2所述。分別在24、48、72、96h用解剖鏡觀察并記錄輪蟲的存活數和死亡數。采用概率單位法計算半致死濃度LC50及其95%置信區間。96h急性毒性實驗結束時，立即從海水對照組和PBDEs試驗組中分別取出輪蟲個體，用載玻片制成標本，在Olympus倒置顯微鏡下拍攝，觀察其形態結構的變化。

1.4 運動抑制實驗

在急性毒性實驗的基礎上，參照《水質物質對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》進行褶皺臂尾輪蟲24h運動抑制實驗，得到抑制率，計算24h 的EC50。根據預實驗結果將BDE-47濃度梯度設置為2.0、6.0、10、14、18和22mg·L-1，將BDE-209設置為6.0、10、20、40、60和80mg·L-1共6個濃度梯度，每個濃度梯度設置3個重復，設置空白對照和助溶劑對照組，其余實驗條件均同1.3所述。

實驗進行24h后在解剖鏡下觀察并記錄褶皺臂尾輪蟲運動受抑制情況，運動抑制的判斷標準[20]為輕輕搖動試驗容器，若輪蟲個體15s之內不能運動，則認為其運動能力受到抑制，得出運動抑制率，計算24hEC50。

1.5 氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)測定實際濃度

樣品的前處理 本實驗首先取適量的樣品以丙酮∶正己烷1∶1混合溶劑萃取，之后進行旋轉蒸發，置換溶劑為正己烷，對萃取物采用由硅膠和氧化鉬組成的多段柱進行凈化，將過柱后的樣品繼續旋蒸，再用氮吹儀濃縮后進行GC-MS分析。

測定條件參數 色譜柱(TG-5MS，15m，0.25mm，0.1μm)，程序升溫：160℃ 2min，35℃ 1min，320℃ 10min，檢測器采用EI離子源，選擇離子掃描，傳輸線溫度：300℃，離子源溫度：250℃。載氣類型：氦氣，橫流模式，載氣流速：1.5mL·min-1。進樣模式：SSL進樣口，300℃，不分流進樣，進樣量：1μL。采用外標法，根據GC-MS測定結果得到PBDEs(x)與其積分面積(y)之間的標準曲線，從而測得實驗設置的BDE-47和BDE-209濃度所對應的在海水溶液中的實際濃度值(見表2)。

1.6 聯合毒性試驗

在急性毒性實驗的基礎上，以單一化合物的96hLC50值為1個毒性單位，分別按濃度1∶1和毒性1∶1以等對數間距設置6～8個試驗質量濃度(見表1)，毒性1∶1采用等毒性配比法[21]。試驗方法及不同暴露時間下的混合LC50值計算方法與急性毒性試驗相同。

表1 BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲聯合毒性實驗濃度梯度設置

1.7 聯合毒性評價方法：Marking相加指數法

采用目前水生毒理學研究中應用較為廣泛的Marking相加指數法[22-23]進行聯合毒性效應的評價。在求得聯合毒性的LC50值以后，應用下列公式求S值：

式中：S為水生生物毒性相加之和；An、Bn分別代表受試毒物單一毒性的LC50值;Am、Bm為混合毒物聯合毒性的LC50值。根據S值求得相加指數(Additive index，AI)，當S≤1時，相加指數AI=(1/S)-1；當S>1時,AI=S(-1)+1。以AI值評價混合毒物的聯合毒性效應，當AI>0時，為協同作用；AI<0時，為拮抗作用；AI=0時，為相加作用。

1.8 數據的處理和分析

采用SPSS Statistics 17.0統計分析軟件對數據進行分析，得出助溶劑DMSO對褶皺臂尾輪蟲的NOEC值、BDE-47和BDE-209對輪蟲的急性毒性效應的概率單位與濃度對數的回歸方程及其24、48、72、96h的LC50和95%置信區間。

2 結果

2.1 助溶劑DMSO對褶皺臂尾輪蟲的NOEC值

根據助溶劑DMSO作用96h后對輪蟲的致死情況(見圖1)，將濃度換算成濃度對數，將死亡率換算成概率單位Probit，運用概率單位法得出DMSO概率單位與體積比濃度對數的回歸曲線方程：y=2.46x-1.29，R2=0.99，且DMSO對褶皺臂尾輪蟲的96h-NOEC值為1.01%，后續實驗中均保證各濃度組DMSO體積比濃度不超過1.01%。

圖1 助溶劑DMSO對褶皺臂尾輪蟲的96h-NOEC值測定Fig.1 Determination of 96 h-NOEC of DMSO on rotifer B. plicatilis

2.2 BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性作用

根據急性毒性試驗結果，隨著BDE-47濃度的升高，褶皺臂尾輪蟲的死亡率升高，但在24h實驗內直至其達到最大溶解度的最高濃度組，BDE-47各濃度組的輪蟲均未死亡超過半數。因此，在25℃左右時，BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的半致死濃度24hLC50>22 mg·L-1。急性毒性實驗開始后，在24h實驗內直至BDE-209達到其最大溶解度的最高濃度組，均沒有對輪蟲產生急性致死作用。據此得出在25℃左右時，BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的半致死濃度24hLC50>80mg·L-1，其海水溶液短時間內毒性極低。BDE-47和BDE-209作用24h對褶皺臂尾輪蟲幼蟲存活的影響見表1。急性毒性實驗中，可以明顯觀察到，高濃度組存活的褶皺臂尾輪蟲運動能力顯著下降，多附著在孔側壁和底部，個體較不活潑。

根據接下來實驗進行到48、72、96h時用解剖鏡觀察記錄的輪蟲存活數和累積死亡數，將濃度換成濃度對數，將死亡率換成概率單位，則得到BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的48、72、96h劑量效應方程、LC50及其95%置信區間(見表3)。結果表明，不同暴露時間下48、72、96h輪蟲死亡率的概率單位(y)與PBDEs質量濃度的對數(x)的關系均為直線回歸，BDE-47和BDE-209對輪蟲的單一毒性死亡與施毒劑量具有良好的相關性，隨著暴露時間的增加，LC50值越小；而且BDE-47在24、48、72和96h的LC50值均比BDE-209的LC50值小，說明BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性比BDE-209更強。

96h急性毒性實驗結束時，通過在倒置顯微鏡下觀察海水對照組、BDE-47試驗組和BDE-209試驗組的輪蟲個體，發現BDE-209試驗組輪蟲個體形態結構變化與對照組相差不大，而BDE-47試驗組的輪蟲個體則發生了明顯的變化。圖2為實驗進行到96h在倒置顯微鏡下拍攝的海水對照組的正常輪蟲個體和2 mg·L-1BDE-47作用下處于中毒狀態的輪蟲個體。與正常個體相比，BDE-47試驗組中毒的輪蟲個體形態發生明顯變化，具體表現為：內部結構模糊，不透明度增加；尾足拖曳或粘附于孔板底部；正常個體形態類似圓柱形，而中毒個體偏向梨形變化，輪盤和背甲萎縮。

圖2 96h正常輪蟲個體(A)和BDE-47中毒輪蟲個體(B)Fig.2 A normal 96 h-rotifer (A) and a rotifer of BDE-47 poisoning for 96 h (B)

2.3 BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的運動抑制作用

BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲24h運動抑制實驗結果顯示，BDE-47在24h內對褶皺臂尾輪蟲具有顯著的運動抑制效應，而BDE-209則無明顯作用。BDE-47和BDE-209作用24h對褶皺臂尾輪蟲幼蟲的運動抑制情況見表2。運用概率單位法得出BDE-47對褶皺臂尾輪蟲運動抑制的24hEC50值為9.695 mg·L-1(y=2.132x-2.104，R2=0.945)，95%置信區間為8.240～11.305。

表2 BDE-47和BDE-209的24h急性毒性脅迫對褶皺臂尾輪蟲幼蟲存活和運動的影響

表3 BDE-47，BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的單一急性毒性實驗結果

2.4 聯合毒性試驗

2.4.1 BDE-47和BDE-209濃度1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性 BDE-47和BDE-209濃度1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性試驗結果見表4。

表4 BDE-47和BDE-209濃度1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性試驗結果

在單一毒性實驗的基礎上，采用BDE-47和BDE-209單一毒性所得96hLC50值為1個毒性單位，進行濃度1∶1的聯合毒性實驗。由表4結果可知，BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性作用隨著污染物的暴露時間不同而存在不同的作用方式。當采用濃度1∶1進行試驗時，暴露時間為24、48h的相加指數AI>0，聯合作用方式表現為協同作用，即在短時間內BDE-47的存在大大增加了BDE-209的毒性，同時BDE-209的存在也大大增加了BDE-47的毒性；而暴露時間為72和96h時，相加指數AI<0，聯合作用方式則為拮抗作用。隨著暴露時間的增加，二者聯合毒性作用從毒性劇增的協同作用轉變為了輕微的拮抗作用，即BDE-209的存在減弱了BDE-47的毒性，同時，BDE-47的存在也減弱了BDE-209的毒性。

2.4.2 BDE-47和BDE-209毒性1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性 BDE-47和BDE-209毒性1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性試驗結果見表5。

表5 BDE-47和BDE-209毒性1∶1時對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性試驗結果

當采用毒性1∶1進行試驗時，BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲聯合毒性作用24、48h時，AI>0，評價結果為協同作用，而暴露時間為72和96h時，AI<0，聯合作用方式為拮抗作用，與濃度1∶1聯合毒性試驗結果相似。

3 討論

3.1 BDE-47和BDE-209的單一急性毒性

急性毒性試驗處在毒理學研究的早期階段，對闡明受試物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。由于水生動物生存在水體中這一特殊性，可以從水體中直接吸附、吸收和攝入污染物，接觸急性毒性試驗是其急性毒性試驗研究的主要形式之一。PBDEs作為一類溴系阻燃劑(Brominated flame retardants，BFRs)，其水溶性很低[24]。本研究的助溶劑實驗結果表明，在24h內BDE-47和BDE-209通過采用助溶劑DMSO，直至在海水中達到其最大溶解度，褶皺臂尾輪蟲均未出現死亡。因此，其海水溶液毒性極低，在受試時間24h內未出現急性致死效應。

本實驗研究了BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的單一急性毒性效應，結果顯示隨著二者濃度的增大和時間的延長，毒性效應會增強，其對輪蟲的毒性影響存在劑量-效應關系和時間-效應關系。隨著暴露時間的增加，LC50值越小，毒性效應越強；BDE-47在48～96h的LC50值均比BDE-209的LC50值小；BDE-47對褶皺臂尾輪蟲具有顯著的運動抑制效應，且在作用96h后，輪蟲的形態和功能都發生了明顯的改變，而BDE-209則無明顯作用。以上結果說明在同等的實驗條件下，BDE-47對褶皺臂尾輪蟲的急性毒性比BDE-209更強。本實驗研究結果與此前國內外研究PBDEs對其他生物作用的實驗結果類似，曾有研究者報道過幾種低溴代聯苯醚對海洋橈足類急性毒性：Berithlltz等[25]測得BDE-47對美麗猛水蚤(Nitocraspinipes)96h-LC50值為72μg/L，Wollenberger等[26]通過急性毒性試驗得到BDE-28、99對湯氏紡水蚤(Acartiatonsa)48h-LC50值分別為108、705μg/L。然而，相比于低溴代的BDE-28、47、99，高溴代的BDE-209毒性要小一些。張澤光等[27]研究發現BDE-209在24和48h內不足以引起大型蚤死亡，48h-EC50>10mg/L，屬于低毒；BDE-209暴露濃度為1mg/L時，對大型蚤的生長和繁殖沒有顯著影響。原因可能是BDE-209分子中溴原子數目多，空間位阻大，較難進入生物體內部，因而毒性相對較小[28]。

3.2 BDE-47和BDE-209的聯合毒性效應探討

近年來，國內外很多學者對于各種污染物對生物的聯合毒性效應研究做了大量工作。在本研究中，BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的聯合脅迫無論是在濃度1∶1條件下還是毒性1∶1條件下，均在不同時間表現出不同的聯合毒性效應。目前已有一些研究表明，聯合毒性作用可能隨著暴露時間的不同而不同。如陳碧鵑等[29]在進行乙醛、對苯二甲酸、乙二醇對鰱、草魚的聯合毒性實驗發現，混合毒物對草魚幼魚的作用隨著實驗時間的不同，聯合毒性效應亦不同。王桂燕等[30]發現Cd2+和對二氯苯對草魚的聯合毒性在24、48、72h為拮抗作用，而96h為協同作用。王春鳳等[31]研究表明汞和硒在濃度1∶1時對劍尾魚的聯合毒性作用24h為拮抗作用，48和96h為協同作用。王琳等[32]報道Cd2+分別與苯并芘、PCB1254對幼貝的聯合作用24h，聯合毒性表現為拮抗作用，48、72、96h為協同作用。修瑞琴等[33]對斑馬魚進行氟與硒的聯合毒性實驗發現，在濃度1∶1的情況下，作用24h為拮抗作用，48h為相加作用，而96h為協同作用。修瑞琴等[34]還在對斑馬魚進行鎘和鋅離子的聯合毒性研究時發現，當濃度1∶1時，暴露時間為24、48和96h聯合作用結果為協同作用，而當毒性1∶1時，暴露時間為24、48h為協同作用，96h時為拮抗作用。因此，聯合毒性作用方式很大程度上取決于受試毒物的種類和特性，且表現為隨暴露時間的不同而不同。

聯合毒性作用方式還可能隨著毒物劑量的不同而不同。Lu等[35]研究了BDE-47和BDE-99對金魚體內一系列酶的活性的影響，結果顯示，當同時處于較低劑量時，兩者之間產生協同作用，當同時處于較高劑量時，則為拮抗作用。因此，本實驗中所采用的BDE-47和BDE-209劑量也可能對此實驗結果產生了一定的影響。

BDE-47和BDE-209的致毒機理和作用機制具有一定的相似性。本研究中，BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性作用24、48h時為協同作用，而暴露時間為72、96h時為拮抗作用。環境污染物對生物的毒性作用機制之一即造成生物體酶的過氧化脅迫。據此推斷二者在造成酶活性下降，破壞抗氧化防御系統時，共同作用于生物體，產生活性氧自由基，對細胞造成損傷，因而毒性增強，表現為協同作用；而之后可能由于發生了某種形式的競爭，共同競爭作用位點，也可能發生了某種化學作用，從而降低了2種毒物的有效濃度，表現為聯合毒性的拮抗作用。國內外已有相關研究表明，PBDEs能夠誘導生物體內產生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，而抗氧化酶防御系統成分的變化能夠指示機體受到氧化脅迫的程度[36-37]，因此，抗氧化酶可以作為PBDEs的生物標記物[38-40]。張喆等[11]發現BDE-209可以誘導紫紅笛鯛產生氧化應激效應，CAT和SOD則在氧自由基清除中發揮作用；吳偉等[41]采用BDE-47和BDE-209分別處理鯽魚肝臟組織，組織中CAT、GPx活性隨二者的質量濃度增加而逐漸下降，說明BDE-47和BDE-209均對鯽魚肝臟產生了氧化損傷，具有生化毒性影響；銅銹環棱螺(Bellamyaaeroginosa)的肝胰臟長時間暴露于BDE-47，可導致CAT活性顯著下降，表現出顯著的劑量或時間依賴效應[42]。可見，化學結構和性質相近的同類有機化合物，通常會以相似的方式和途徑作用于生物體。然而，影響聯合毒性作用的因素較多，包括生物因素、環境因素等，有關BDE-47和BDE-209對褶皺臂尾輪蟲的聯合毒性作用的途徑和機理尚需進一步的研究與探討。李子文等[43]研究表明，BDE-209和PCB-153均具有遺傳毒性，在致大鼠肝細胞DNA蛋白質交聯(DPC)上會產生拮抗作用。BDE-209和PCB-153分別是PBDEs和PCB家族的主要同系物，并且同時存在于環境和人體組織中。因此，有關專家指出，PBDEs與其它環境污染物，如與結構性質相似的多氯聯苯(PCB)等污染物之間形成的復合污染及聯合毒性效應方面的研究也是今后工作的重點[44]。海洋環境污染通常以復合污染的形式出現，因此，污染物對海洋生物的聯合毒性效應已成為亟待解決的研究課題，這對于海洋污染監測具有重要意義。

由于具有高親脂性，PBDEs在實際海洋水體中的水溶性非常低，溶解態BDE-47的濃度約為0.07 mg·L-1，溶解態BDE-209的濃度僅為0.02～0.03 mg·L-1[24]。然而，相關學者指出，在較短時期內能夠產生毒理觀察效應的BDE-47和BDE-209設計暴露水平往往須高于目前報道中的實際環境濃度[25]。本研究通過GC-MS對實驗體系中的BDE-47與BDE-209進行了實際溶解濃度的測定，結果顯示，實驗體系中的實際濃度遠低于實驗設計所配置的濃度，結果也證實了BDE-47和BDE-209均難溶于水，且BDE-209比BDE-47溶解度更低。在本研究中，輪蟲主要通過海水介質接觸PBDEs，因此認為輪蟲吸收途徑是通過體表直接吸收。在自然環境中，輪蟲吸收PBDEs的主要途徑可能還有攝食。生物在實際環境中可能暴露于一系列PBDEs，同系物之間會發生轉化，從而產生更強大的毒性效應。本研究對此后相關的PBDEs生物富集以及更低濃度長期暴露方面的研究具有一定的參考價值和意義。

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責任編輯 高 蓓

Study on Single and Joint Toxic Effects of Two PBDEs(BDE-47, BDE-209)on RotiferBrachionusplicatilis

SHA Jing-Jing1, WANG You1, WANG Hong1, CHEN Yue2,LI Xiao-Hong1, XU Ning-Ning1, TANG Xue-Xi1

(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. The Second Institute of Oceanography, Soa, Hangzhou 310012, China)

In order to enrich the research about the impact of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) on zooplankton in the marine environment, the toxic effects of single and joint BDE-47 and BDE-209 in different concentrations on rotiferBrachionusplicatiliswere examined under controlled laboratory conditions. The toxicity tests of BDE-47 showed that theLC50values for 48, 72 and 96 h of BDE-47 forB.plicatiliswere 2.113, 0.376, 0.163 mg/L, respectively. They were all less than those of BDE-209 which were 11.162, 1.237, 0.295 mg/L, respectively. Therefore, BDE-47 was found to be more toxic toB.plicatilisthan BDE-209 under laboratory conditions. The joint toxic effects of BDE-47 and BDE-209 were examined with setting up the concentration as 1∶1 and the toxicity as 1∶1. The Marking additive index method was used to evaluate the joint toxicity. The results of the two ways were similar, which showed that the joint toxic effects of BDE-47 and BDE-209 were synergistic at 24 and 48 h, while the joint toxic effects changed to antagonistic at 72 and 96 h. We concluded that as the increase of exposure time within 96 h, the joint toxic effects of BDE-47 and BDE-209 changed from synergy to mild antagonism.

BDE-47; BDE-209;Brachionusplicatili; acute toxicity; joint toxicity

國家自然科學基金項目(41276140)；國家自然科學基金委員會-山東省人民政府海洋科學研究中心聯合資助項目(U1406403):海洋生態與環境科學資助

2014-10-15；

2015-04-10

沙婧婧(1987-)，女，博士生，主要從事海洋生態學和生態毒理學研究。E-mail：shajingjingouc@163.com

?? 通訊作者： E-mail：tangxx@ouc.edu.cn

P734.4

A

1672-5174(2015)09-069-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20140314