基于體外抗腫瘤活性的海洋中藥牡蠣提取物HPLC化學輪廓譜研究?

楊 雪， 馬愛翠， 陳 震， 付志飛， 戚 欣， 李 靜， 管華詩， 劉紅兵??

(1. 中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室，山東 青島 266003; 2. 山東國際生物科技園發展有限公司，山東 煙臺 264670)

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基于體外抗腫瘤活性的海洋中藥牡蠣提取物HPLC化學輪廓譜研究?

楊 雪1,2， 馬愛翠1， 陳 震1， 付志飛1， 戚 欣1， 李 靜1， 管華詩1， 劉紅兵1??

(1. 中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室，山東 青島 266003; 2. 山東國際生物科技園發展有限公司，山東 煙臺 264670)

牡蠣等貝殼類中藥的90%以上成分都是碳酸鈣，現版藥典對該類藥材的質量控制均以碳酸鈣含量為指標。由于貝類中藥的功能主治不盡相同，除碳酸鈣以外還可能存在其他功效成分。為在有效成分不明確的情況下表征牡蠣飲片的質量，本文在評價抗腫瘤活性的基礎上研究牡蠣藥材化學輪廓譜，為牡蠣藥材的質量控制提供科學依據。收集12批次牡蠣藥材，體外測試牡蠣甲醇提取物對9種腫瘤細胞株的增殖抑制作用，發現牡蠣甲醇提取物具有廣譜的體外抗腫瘤活性，提示小分子有機質是牡蠣發揮“軟堅散結”抗腫瘤作用的不可忽視的藥效物質基礎。采用高效液相色譜分析化學組成，進行相似度評價；舍去活性較差且化學成分相似度不高的樣品，建立化學輪廓譜；采用雙變量相關分析考察“譜-效”相關性，發現3個共有峰與活性有明顯相關，可以作為質量控制的指標性成分，建立的牡蠣藥材甲醇提取物化學輪廓譜能較好地體現其“軟堅散結”抗腫瘤功效。

中藥牡蠣； 海洋中藥； 化學輪廓譜； 抗腫瘤

牡蠣是世界各國沿海常見的可食用貝類，屬軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)絲鰓亞綱(Filibranchia)珍珠貝目(Pteriida)動物。在中國，牡蠣貝殼作為中藥使用已有上千年的歷史，目前仍為臨床常用[1-2]。據中國藥典2010版記載，中藥牡蠣的基源是牡蠣科動物長牡蠣Ostreagigas、大連灣牡蠣O.talienwhanensis或近江牡蠣O.rivularis的貝殼，能重鎮安神，潛陽補陰，軟堅散結。

在現版國家藥典中，中藥牡蠣的質量是以碳酸鈣的含量為指標進行控制的。這是由于貝殼中90%以上的成分是以碳酸鈣為主的無機鹽。除了牡蠣,藥典中收載的其它類似中藥如瓦楞子等貝殼類藥材，均以碳酸鈣含量為指標進行質量控制。那么，以貝殼的主要化學成分碳酸鈣含量作為該類藥材的唯一質控指標，是否合理？已知貝殼類中藥的功效各異，蛤殼為化痰止咳藥，牡蠣、石決明和珍珠母同為平肝潛陽藥；但后三者又有區別，牡蠣兼具軟堅散結之功，石決明卻能清肝明目，珍珠母則為定驚明目。僅用碳酸鈣不能很好地解釋貝類中藥功有專長的真正原因，該成分不合適作為該類藥材質量控制的唯一指標。

貝殼作為軟體動物的外骨骼，實際上是一種排列有序的天然有機-無機復合材料。生物礦化學研究表明，貝殼有機質由蛋白質、多糖或糖蛋白、磷蛋白、類胡蘿卜素等組成，含量占殼干重的0.3%～5%左右[3-5]。但貝類中藥藥效物質基礎的相關研究，目前僅見有針對無機鹽的報道(碳酸鈣為主)，未見有針對貝殼有機質及其生物活性的研究報道。基于以上原因，課題組對中藥牡蠣的有機質成分開展系統研究[6]。利用高效液相色譜法分析多批次牡蠣甲醇提取物；鑒于中醫的軟堅散結功效與西醫的抗腫瘤功效有著密切的相關性[7-8]，測試樣品的體外細胞毒作用；并以活性結果為指導，探討中藥牡蠣藥材的化學輪廓譜及可能的效應成分。

1 儀器材料

美國Agilent 1100高效液相色譜儀(包括四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、色譜工作站)；Sunfire C18色譜柱(美國Waters公司，4.6mm×250mm，5μm)；Bond-Elut C18固相萃取柱(100mg,3mL,美國Varian公司)；A-5002酶標儀(奧地利Tecan公司)；MilliQⅡ型純水系統(美國Millipore公司)。

甲醇、乙腈均為色譜純(美國Honeywell公司)；其它試劑為分析純。細胞培養用1640培養基、MEM培養基、DMEM培養基和F12K培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)。

12批牡蠣飲片(生品)于2008—2011年自山東、河北等地購買(見表1)，經中國海洋大學醫藥學院劉紅兵副教授鑒定，憑證保存于中國海洋大學醫藥學院生藥標本室。

表1 中藥牡蠣(生)飲片的來源

體外抗腫瘤實驗使用的人慢性髓原白血病K562、人原髓細胞白血病HL-60、人宮頸癌細胞Hela、人非小細胞肺腺癌A549、人肝癌細胞BEL-7402、人肝癌細胞SMMC-7721、人腎癌細胞OS-RC-2、人結直腸腺癌細胞Caco-2、人胃癌細胞MGC80-3等9種腫瘤細胞株，均購自中科院上海細胞庫。

2 實驗方法

2.1 牡蠣甲醇提取物的制備

取各批牡蠣飲片，粉碎后過40目篩。分別稱取100g，加入5倍量甲醇，回流提取1.5h，共提3次。合并提取液，3000r·min-1離心10min；取上清液，40℃減壓濃縮至干；加入3mL蒸餾水，渦旋溶解后，過預先活化的C18固相萃取小柱。先用3mL蒸餾水淋洗脫鹽，再用6mL甲醇洗脫；收集甲醇洗脫組分，減壓干燥，得牡蠣飲片的甲醇提取物S1～S12。

2.2 體外細胞毒活性評價

2.2.1 供試品的制備 分別精密稱取牡蠣甲醇提取物S1～S12，加入適量DMSO配成10mg·mL-1的溶液；經0.22μm無菌微孔濾膜過濾后，供體外抗腫瘤活性測試。

2.2.2 體外抗腫瘤實驗 腫瘤細胞于37℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱中進行培養，2～3d傳代一次。分別取對數生長期的細胞，用相應的培養基配制成2×104～3×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔180μL；培養24h后，實驗組每孔加入20μL稀釋后的待測樣品溶液(樣品終濃度50μg·mL-1)，空白對照組加入20μL等倍稀釋的溶劑，陽性對照用阿霉素(終濃度0.5μg·mL-1)。繼續培養72h后，分別采用SRB法[9-10](對Hela、A549、BEL-7402、SMMC-7721、OS-RC-2、Caco-2和MGC80-3細胞)或MTT[11-12]法(對K562和HL-60細胞)測定。每個樣品設6個復孔。按下列公式計算細胞增殖抑制率：抑制率(IR%)=[(A空白對照-A實驗組)/A空白對照]×100%。

2.3 牡蠣甲醇提取物的HPLC分析

2.3.1 HPLC色譜條件 Waters Sunfire C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A相為pH=2.5磷酸水溶液，B相為乙腈；洗脫梯度0～5min：5% B；5～25min：5%～100% B；25～35min：100%B；流速1mL·min-1；柱溫35℃；進樣體積20μL；檢測波長210nm。2.3.2 供試品的制備 分別精密稱取牡蠣甲醇提取物S1～S12，用HPLC級甲醇溶解，配成濃度為20mg·mL-1的溶液；10000r·min-1離心10min；吸取上清液，即得供試品溶液。

2.4 數據分析軟件

HPLC原始數據通過安捷倫工作站Chemstation for LC處理獲得峰面積積分數據。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A版(國家藥典委員會)進行色譜峰對齊、相似度評價和共有峰的識別。使用IBM-SPSS Statistics 19.0進行聚類分析、主成分分析和雙變量相關分析。

3 結果與討論

3.1 牡蠣甲醇提取物的細胞毒活性

從表2可見，各批次牡蠣甲醇提取物都能不同程度地抑制腫瘤細胞的增殖，具有廣譜的體外抗腫瘤活性。牡蠣所含的小分子有機質是其發揮“軟堅散結”抗腫瘤作用的、不可忽視的重要藥效物質基礎之一。

為深入探討牡蠣甲醇提取物的抗腫瘤活性，本研究對以上活性數據分別進行聚類分析(Hierarchical Cluster analysis, HCA)和主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。以Ward法連接所得的HCA分析結果如圖1所示，牡蠣樣品S7、S8、S9、S10聚為一類，S3、S4、S5、S6、S11聚為一類，S1、S2、S12聚為一類。

表2 牡蠣甲醇提取物S1～S12對腫瘤細胞的增殖抑制率

根據Kaiser原則，以特征值大于1標準確定要保留的主成分數。結合表3中的信息可知，PC1和PC2特征值大于1，二者累積貢獻率達到81.935%，能夠反映出絕大部分的信息，因此確定2個主成分，其得分圖見圖2。由圖2可知，牡蠣樣品S7、S8、S9、S10聚為一類，S3、S4、S5、S6、S11聚為一類，S1、S2、S12聚為一類。所得結果與HCA結果一致，兩種方法可以相互佐證，所得結果真實可靠。結合圖2和表2可知，沿橫坐標軸的正方向，牡蠣的抗腫瘤活性呈增大趨勢。

載荷量的絕對值越大，說明其對應的主成分受該指標的影響也越大。由表4可知，特征值貢獻率為70.416%的PC1，對9個細胞株均有較大的正值負荷(>0.7)。特征值貢獻率為11.519%的PC2，對各細胞株負荷不大(最高僅-0.499)。由于PC1的特征值貢獻率大，是分析的主要方面。因此可以得出結論，各批次的牡蠣甲醇提取物對不同腫瘤細胞增殖抑制表現為廣譜性；其中牡蠣飲片S7、S8、S9、S10的甲醇提取物抗腫瘤效果最好，而S1、S2、S12的甲醇提取物效果總體較差。

圖2 不同牡蠣對腫瘤細胞增殖抑制的PCA得分圖Fig.2 PCA scores of 12 batches of Ostreae concha

成分PC特征值Eigenvalue貢獻率/%Individualvariance累計貢獻率/%Cumulatevariance16．33770．41670．41621．03711．51981．93530．6537．25189．18640．3844．26393．45050．3343．71097．16060．1641．81998．97970．0770．85699．83580．0090．09799．93290．0060．068100．000

表4 PCA分析所得因子載荷矩陣

3.2 牡蠣甲醇提取物的HPLC化學輪廓譜

取供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件依次進樣檢測，記錄色譜圖，得到12份牡蠣飲片甲醇提取物的HPLC圖譜(見圖3)。將HPLC色譜圖積分處理后，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004版》軟件進行分析，發現樣品S1、S12、S2、S4等4批甲醇提取物樣品與對照指紋圖譜的相似度差異很大，分別為0.09、0.19、0.23和0.30。采用相似度軟件，對齊12批牡蠣甲醇提取物的色譜峰后共得到117個峰，其中共有峰僅有3個(峰號8、18、28)。

在本研究中發現化學成分差異較大的樣品(S1、S12、S2、S4)與生物活性差異較大的樣品(S1、S2、S12)基本一致，提示牡蠣小分子有機質是其發揮“軟堅散結”抗腫瘤作用的藥效物質基礎。基于以上原因，根據抗腫瘤活性數據，舍棄活性較差的樣品S1、S2、S12，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，考察牡蠣樣品(S3～S11)的化學輪廓譜。結果如圖4所示，共標定出10個共有峰(峰號8、18、28、32、35、88、89、93、96、110)。

圖3 12批牡蠣飲片甲醇提取物的HPLC圖(210 nm)Fig.3 HPLC chromatograms of 12 batches of Ostreae concha (at 210 nm)

圖4 活性牡蠣飲片甲醇提取物的HPLC化學輪廓譜(210 nm)Fig.4 HPLC chemical profile of Ostreae concha (at 210 nm)

3.3 牡蠣甲醇提取物的效應成分分析

采用雙變量相關分析(bivariate correlation analysis)將藥效學信息與HPLC化學輪廓譜信息進行相關性研究，計算各牡蠣甲醇提取物的HPLC色譜峰峰面積與其對應的抗腫瘤活性之間的Pearson相關系數。所得相關系數越大，則表明該色譜峰對活性的影響越大。抗腫瘤活性變量，用抗腫瘤活性PCA中第一主成分(PC1)得分進行表征。關于HPLC色譜峰峰面積變量，由于各牡蠣甲醇提取物HPLC化學輪廓譜差異較大，而所選色譜峰的不同將直接影響CCA結果，為使分析結果更可信，本文分別采用以下兩種選取方法進行分析比較。

表5 牡蠣甲醇提取物HPLC色譜峰(排名前20)峰面積和抗腫瘤活性PC1得分之間的Pearson相關系數

Note：*P< 0.05; **P<0.01; ①Peak No.;②Correlation efficient.

方法一 對所有12個樣品逐一分析，選取每個樣品中含量排名前20的色譜峰，匯總后，取其并集，共得到84個色譜峰；考察所得84個色譜峰峰面積與抗腫瘤活性PC1得分之間的相關性。表5所示的分析結果表明，32號、35號、61號、96號峰和抗腫瘤活性之間存在顯著的相關(相關系數>0.7，P<0.01)。

方法二 考察化學輪廓譜10個共有峰與抗腫瘤活性之間的相關性，該方法是中藥譜效關系研究中通常采用的策略[13]。表6所示的分析結果表明，共有峰32號、35號、96號峰和抗腫瘤活性PC1得分之間存在明顯的相關(相關系數>0.7，P<0.01)。從表6還可看到，12批牡蠣甲醇提取物的3個共有峰(峰號8、18、28)，與抗腫瘤活性的相關性都不大。

表6 牡蠣甲醇提取物HPLC色譜峰(共有峰)峰面積和抗腫瘤活性PC1得分之間的Pearson相關系數

Note：*P< 0.05; **P<0.01; ①Peak No; ②Correlation efficient.

比較方法一和方法二，發現兩種方法的結果基本一致，即32號、35號、96號峰與抗腫瘤活性之間存在明顯的相關，提示這些色譜峰可能是牡蠣甲醇提取物發揮抗腫瘤作用的藥效物質基礎。此外，方法一還給出了61號峰。盡管該色譜峰不是牡蠣藥材的共有峰，但通過檢查峰面積原始數據發現，61號峰在活性較強的樣品S6～S10、S3中含量較多，而在活性較弱的樣品S1，S2，S12中未檢測到，這提示61號峰可能也是牡蠣甲醇提取物抗腫瘤的效應成分之一。

同時，兩種相關性分析結果的一致性還表明，本文所建立的化學輪廓譜較為可靠，能反映牡蠣藥材“軟堅散結”抗腫瘤的藥效物質基礎。對于HPLC圖譜差異較大的中藥藥材，為獲得更能反映生物活性的化學輪廓譜/指紋圖譜，有必要舍去活性較差且化學成分相似度不高的樣品。同時，在制定藥材的質量控制標準時，不應忽視含量較低的化學成分，這些成分有可能是發揮藥效的重要活性物質。

牡蠣是多基源藥材，除了物種這個主要影響因素以外，還受到生長環境、生長年限等外界因素的影響。目前市售牡蠣藥材質量良莠不齊，因此極有必要建立合理、切實可行的藥材質量標準評價體系，以保證藥材質量的可控性和有效性。牡蠣是貝殼類中藥，90%以上成分都是碳酸鈣，所含有機質的量低微，闡明其化學組成難度很大。為在有效成分不明確的情況下有效表征牡蠣飲片的質量，本文對多批次牡蠣殼有機質進行提取，在評價其抗腫瘤活性的基礎上考察其化學輪廓譜；并利用化學計量學方法對化學組成-生物活性這兩者的關聯度進行分析，從而確定抗腫瘤效應成分。本研究為其質量控制提供有效方法和科學根據，并為牡蠣“軟堅散結”功效物質基礎的研究提供依據。

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責任編輯 徐 環

HPLC Profile Analysis of Marine-Derived Traditional Chinese MedicineOstreaeconchaBased on the Anti-Tumor Effectinvitro

YANG Xue1, 2, MA Ai-Cui1, CHEN Zhen1, FU Zhi-Fei1, QI Xin1,LI Jing1, GUAN Hua-Shi1, LIU Hong-Bing1

(1. The Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China； 2. Shandong International Biotechnology Park Development Co. Ltd, Yantai 264670, China)

The quality control ofOstreaeconchain current edition of Chinese pharmacopeia relies on the content of calcium carbonate, which accounts for more than 90% of the gradients ofOstreaeconchaand other shellfishes. Judging from the different efficacies of conch medicine, there may be other functional components other than calcium carbonate. The aim of the present study is to establish the chemical profile ofOstreaeconchabased on the evaluated anti-tumor activity, and to provide a scientific basis for the quality control ofOstreaeconchawithout clarifying the effective components. Twelve batches ofOstreaeconchawere collected and their anti-proliferation effects against nine kinds of cancer cell lines were testedinvitro. The results showed that the methanol extract of theseOstreaeconchahad broad-spectrum anti-tumor activity, suggesting that small molecular components were the effective substances corresponding to its anti-tumor activity. This effect is in accord with the “softening and resolving hard masses” effect ofOstreaeconcha. Chemical compositions of theseOstreaeconchawere further analyzed by HPLC and the similarities were calculated. The simulated chemical profile ofOstreaeconchawas then deduced after dismissing the samples with poor bioactivity and low similarity. By bivariate correlation analysis of the spectrum-effect relationship, the anti-tumor constituents were found to be significantly associated with three common peaks, which could be used as the index components for quality control. Indeed, the established chemical profile of medicinalOstreaeconchacorrelates very well with its “softening and resolving hard masses” effect.

Ostreaeconcha; marine-derived traditional Chinese Medicine; chemical profile; anti-tumor

國家高技術研究發展計劃項目(2013AA093003)；山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金項目(BS2011YY065)資助

2014-08-21；

2014-09-09

楊 雪(1983-)，女，博士。E-mail：yangxue95@163.com

?? 通訊作者： E-mail：liuhongb@ouc.edu.cn

R284

A

1672-5174(2015)09-090-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150249