耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌表型檢測及其耐藥性研究*

萬 芳，陳 恒，柯茂彬，崔敏濤，魯 艷，李永聯(lián)，吳學(xué)詩(.廣東省佛山市同江醫(yī)院檢驗科 58300；.湖北省孝感市中心醫(yī)院院感科 4300)

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耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌表型檢測及其耐藥性研究*

萬 芳1，陳 恒1，柯茂彬1，崔敏濤1，魯 艷2，李永聯(lián)1，吳學(xué)詩1(1.廣東省佛山市同江醫(yī)院檢驗科 528300；2.湖北省孝感市中心醫(yī)院院感科 432100)

目的 了解耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)感染狀況及其產(chǎn)酶類型。方法 采用最低抑菌濃度(MIC)法分析腸桿菌科細菌的耐藥情況。采用厄他培南紙片擴散法初篩產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，對初篩陽性菌株分別采用改良Hodge試驗、加硼酸或苯唑西林的改良Hodge試驗、EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法進行表型確證。結(jié)果 腸桿菌科細菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為2.7%、2.3%。厄他培南紙片擴散法初篩陽性菌株11株，其中改良Hodge確證試驗陽性(或弱陽性)菌株3株，包括產(chǎn)金屬酶菌株1株，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)或AmpC 酶菌株2株。2株改良Hodge確證試驗弱陽性菌中未檢出碳青霉烯酶基因，但檢出AmpC、TEM、CTX-M基因，改良Hodge試驗陽性菌中檢出blaIMP 基因。結(jié)論 改良Hodge試驗、加硼酸或苯唑西林改良Hodge試驗及EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法相結(jié)合進行碳青霉烯酶檢測，在暫無條件開展基因分型的醫(yī)院具有很好的應(yīng)用前景。

腸桿菌科細菌； 碳青霉烯酶表型； 耐藥性分析

碳青霉烯類抗菌藥物以其對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、毒性低等特點，已成為臨床治療腸桿菌科細菌重癥感染最主要的抗菌藥物之一。近年文獻報道顯示，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)迅速增多，給臨床抗感染治療帶來了極大困擾。產(chǎn)生碳青霉烯酶是CRE對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因[1]。基因分析是檢測碳青霉烯酶最成熟的方法，但由于其操作步驟繁瑣、費用高、需特殊儀器，不能用于常規(guī)檢測[1]。本研究旨在建立快速、簡便、準(zhǔn)確的CRE表型確證方法，從而了解同江醫(yī)院CRE感染情況及其產(chǎn)酶類型，現(xiàn)報道如下。

1 材料 與方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月到2014年6月同江醫(yī)院初次分離臨床采集的對1種或多種第三代頭孢菌素耐藥的腸桿菌科細菌(耐藥腸桿菌科細菌)共300株。標(biāo)本來源包括靜脈血、中段尿、膿液、痰、氣管內(nèi)抽吸液、肺泡灌洗液、傷口分泌物等，采用Phoenix100微生物自動鑒定與藥敏系統(tǒng)鑒定到種，產(chǎn)碳青霉烯酶初篩陽性菌株采用半固體培養(yǎng)基保存于4 ℃條件下，每3個月轉(zhuǎn)種。

1.2 儀器與試劑 亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)藥敏紙片、MH瓊脂購自杭州天和微生物有限公司；厄他培南(ETP)藥敏紙片購自英國Oxoid公司；血平板、巧克力、麥康凱平板購自廣州市迪景微生物科技有限公司。苯唑西林鈉(瑞陽制藥有限公司)，苯硼酸(北京維達化工有限公司)，EDTA(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，二甲基亞砜(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，BD 9120血培養(yǎng)儀、Phoenix100微生物自動鑒定與藥敏系統(tǒng)均為美國BD公司產(chǎn)品。基因檢測由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心合作完成。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗 在全自動細菌鑒定儀上采用最低抑菌濃度(MIC)法測定，根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)2010的標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.3.2 碳青霉烯酶篩選和表型確證試驗 (1)初篩：采用CLSI推薦的厄他培南紙片擴散法，實驗方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[2]。(2)改良Hodge試驗：對初篩陽性菌株用改良Hodge試驗進行確證，實驗方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[2]。(3)金屬酶表型篩選試驗：對改良Hodge試驗陽性菌株進行EDTA亞胺培南復(fù)合紙片法，實驗方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[3]。(4)加硼酸與苯唑西林的改良Hodge試驗：參照文獻[4]，通過不同的圖形來區(qū)分A組碳青霉烯酶、AmpC 酶及非A組碳青霉烯酶。

1.4 基因確證 對改良Hodge表型確證試驗陽性菌株及部分陰性的可疑菌株進行PCR檢測Ambler A組碳青霉烯酶基因(blaKPc、blaIMI)，Ambler B組碳青霉烯酶基因(blaIMPbla)和Ambler D組碳青霉烯酶基因(blaOXA)，對改良Hodge試驗陽性株加測AmpC 及ESBL基因(blaTEM、blaSHV和blaCTX-M)。所用引物參考文獻[5-7]，與廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心合作完成基因檢測。

1.5 臨床資料分析 回顧分析改良Hodge表型確證試驗陽性菌株及部分陰性的可疑菌株患者的臨床資料，包括一般個人資料、用藥情況、感染潛在危險因素等。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥腸桿菌科細菌分布情況 300株耐藥腸桿菌科細菌的菌種分布以大腸埃希菌(168株，56.0%)和肺炎克雷伯菌(108株，36.0%)為主，另有陰溝腸桿菌6株(2.0%)、產(chǎn)氣腸桿菌6株(2.0%)、奇異變形桿菌6株(2.0%)、弗勞地枸櫞酸桿菌3株(1.0%)、產(chǎn)酸克雷伯菌3株(1.0%)。300株耐藥腸桿菌科細菌的標(biāo)本分布：痰(40.8%)、中段尿(31.1%)、靜脈血(10.8%)、其他無菌體液及膿液等(共17.3%)。

2.2 耐藥腸桿菌科細菌藥敏結(jié)果 分離的300株耐藥腸桿菌科細菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為2.7%、2.3%，對阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均低于10.0%，除此以外，對其他常用藥物的體外耐藥率均大于50.0%，見表1。

表1 300株耐藥腸桿菌科細菌藥敏結(jié)果(%)

續(xù)表1 300株耐藥腸桿菌科細菌藥敏結(jié)果(%)

2.3 碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果 厄他培南紙片擴散法初篩碳青霉烯酶表型為陽性的耐藥腸桿菌科細菌共11株，陽性率為3.67%，其中5株經(jīng)MIC法檢測對美羅培南或亞胺培南敏感或中介。改良Hodge確證試驗弱陽性2株，陽性1株(圖1A)，均為肺炎克雷伯菌，對這3株改良Hodge確證試驗陽性菌進行金屬酶及加硼酸、苯唑西林的改良Hodge試驗，檢出金屬酶表型陽性菌1株(圖1B)，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)或AmpC 酶2株(圖1C、1D)。

注：A為改良Hodge確證試驗結(jié)果，其中單箭頭表示弱陽性，雙箭頭表示陽性；B為金屬酶表型篩選試驗陽性結(jié)果；C為加硼酸改良Hodge試驗結(jié)果，其中雙箭頭表示陽性，單箭頭表示陰性；D為加苯唑西林改良Hodge試驗結(jié)果，其中雙箭頭表示陽性，單箭頭表示陰性。

圖1 碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果

2.4 基因檢測 送檢的11株初篩碳青霉烯酶表型陽性的耐藥腸桿菌科細菌中，改良Hodge試驗陰性的菌株菌未攜帶blaKPc、blaIMI、blaIMP、blaOXA碳青霉烯酶基因，2株改良Hodge試驗弱陽性的菌株中未檢出相關(guān)碳青霉烯酶基因，但檢出了AmpC、TEM、CTX-M基因，改良Hodge試驗陽性菌株中檢出了blaIMP 基因，見表2。

2.5 方法學(xué)比較 以基因檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較了MIC法、厄他培南紙片擴散法、改良Hodge試驗、加硼酸與加苯唑西林Hodge試驗結(jié)合金屬酶表型篩選試驗的診斷性能，見表3。

表2 基因分析與表型檢測結(jié)果比較

注：kpn表示肺炎克雷伯菌；+/-表示弱陽性；+表示陽性；-表示陰性。

表3 不同方法檢測碳青霉烯酶診斷性能(%)

2.6 臨床資料分析 查閱相關(guān)患者的病歷資料，本研究菌株來源以老年患者、ICU住院患者及手術(shù)患者為主，多有轉(zhuǎn)科、使用呼吸機、連續(xù)使用頭孢菌素類抗菌藥物超3 d以上的記錄，尤其在檢出改良Hodge確證試驗陽性菌的3例患者中，有1例患者連續(xù)使用頭孢菌素類抗菌藥物5 d，1例患者連續(xù)使用哌拉西林/他唑巴坦超過7 d，1例患者7 d內(nèi)交替使用哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南、左氧氟沙星，甚至發(fā)現(xiàn)在同一科室中有使用同一種頭孢菌素類抗菌藥物的用藥習(xí)慣。

3 討 論

大多數(shù)醫(yī)院在全自動細菌鑒定儀上采用MIC法檢測CRE，但由于KPC型碳青霉烯酶(KPC酶)一般僅引起細菌對碳青酶烯類藥物低水平耐藥，常規(guī)檢測方法易誤認為產(chǎn)ESBLs，不能有效檢測出產(chǎn)KPC酶菌株[8-9]。CLSI推薦的改良Hodge試驗用于碳青霉烯酶表型確證，亦存在特異性較低、無法分型、產(chǎn)ESBLs或AmpC 酶菌株易導(dǎo)致試驗假陽性的缺點[10]。而利用加硼酸或加苯唑西林的改良Hodge試驗，能夠很簡單地區(qū)分出A組、非A組碳青霉烯酶與ESBLs或AmpC 酶，聯(lián)合B類金屬酶篩選試驗則可在不使用基因分析的基礎(chǔ)上快速、簡便、準(zhǔn)確地對CRE進行表型確證分型[11]，這在暫無條件開展基因分型的醫(yī)院具有很好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果亦顯示出其較佳的診斷性能，與以往研究不同的是，4種方法均有較好的敏感性與陰性預(yù)測值[12]，分析原因為本次檢測的菌株數(shù)量較少，可能存在統(tǒng)計學(xué)偏差。CLSI在2013年更新了碳青霉烯酶篩選試驗的判斷標(biāo)準(zhǔn)，可以較好地篩選出疑似產(chǎn)酶株，大大減少了實際工作中CRE監(jiān)測的工作量；酶抑制劑的應(yīng)用可較準(zhǔn)確地分析出細菌耐藥機制，對及時識別CRE、合理選擇抗菌藥物及醫(yī)院感染防控有重要意義。

CRE耐碳青酶烯類抗菌藥物的機制簡單說來主要有兩大類，其一為膜孔蛋白表達質(zhì)和(或)量的缺失合并對碳青霉烯類抗菌藥物有微弱水解活性的β內(nèi)酰胺酶(AmpC 酶和ESBLs)的過表達；另一機制是獲得具有編碼碳青霉烯類抗菌藥物水解活性的碳青霉烯酶基因[13]。在我國，腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制主要是產(chǎn)KPC酶和金屬酶[14]。本研究未檢出KPC酶，但檢出了1例產(chǎn)金屬酶的肺炎克雷伯菌，這與患者來源、檢測數(shù)量及地域性差異有關(guān)。需要特別注意的是，本次通過改良Hodge試驗檢出了產(chǎn)AmpC 和產(chǎn)ESBLs的菌株，這些細菌以過表達AmpC 酶合并OmpF或OmpC膜孔蛋白修飾為特征，同時社區(qū)獲得性產(chǎn)CTX-M型菌株在世界范圍內(nèi)的廣泛播散導(dǎo)致厄他培南耐藥菌株不斷出現(xiàn)[15]，給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。

導(dǎo)致CRE產(chǎn)生的危險因素包括侵襲性操作(特別是外科手術(shù))、導(dǎo)尿管留置、床位的頻繁更換和應(yīng)用廣譜抗菌藥物[16-17]。也有資料顯示，對有基礎(chǔ)并發(fā)病的患者，醫(yī)院獲得性感染比抗菌藥物選擇更重要[18]。本研究發(fā)現(xiàn)碳青酶烯類抗菌藥物的應(yīng)用不是導(dǎo)致本院出現(xiàn)產(chǎn)酶菌株的主要原因，不良的用藥習(xí)慣、高危人群的存在、醫(yī)務(wù)人員感染防控意識不強，更能導(dǎo)致耐藥菌株的播散。

對CRE的控制手段中，早期識別雖然重要，防患于未然更重要，只有加強對抗菌藥物臨床合理應(yīng)用的監(jiān)管，減少侵襲性操作，掌握CRE早期監(jiān)測手段，嚴格執(zhí)行手衛(wèi)生，實施接觸防護措施，大力發(fā)揮公共衛(wèi)生機構(gòu)的作用，擴大CRE防控范圍[13]，同步做好院感防控、監(jiān)測、治療三方面的工作，才能真正做到控制CRE多重耐藥菌醫(yī)院感染的發(fā)生。

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Research on the phenotype and drug resistance of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae*

WANFang1，CHENHeng1，KEMao-bin1，CUIMin-tao1，LUYan2，LIYong-lian1，WUXue-shi1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TongjiangHospital,Foshan,Guangdong528300,China;2.DepartmentofHospitalInfectionControl,CentralHospitalofXiaogan,Xiaogan,Hubei432100,China)

Objective To explore the phenotype and drug resistance of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae(CRE).Methods Minimal inhibitory concentration(MIC) method was used to analyze the drug resistance of Enterobacteriaceae.Kirby-Bauer (Ertapenem) was used to screen the carbapenemases strains.Improving Hodge experiment，the one with adding boric acid and Kirby-Bauer compounding oxacillin and EDTA-Imipenem were used to confirmed the phenotype.Results The drug resistance rate of Enterobacteriacea to imipenem(IPM) and meropenem (MEM) were 2.7% and 2.2%，in 11 pcs screening positive by Kirby-Bauer (ETP)，3 pcs improved Hodge tested positive，1 pic carbapenemases tested by phenotype，2 pcs ESBLs or AmpC enzyme.2 pcs weekly positive tested AmpC，TEM，and CTX-M gene，not carbapenemases.The blaIMP gene were tested.improved Hodge positive plants.Conclusion The corporation of improved Hodge experiment，the one with adding boric acid and Kirby-Bauer compounding oxacillin and EDTA-Imipenem has good performance on CRE testing.

Enterobacteriaceae； carbapenemases； analysis of drug resistance

廣東省佛山市順德區(qū)醫(yī)學(xué)科研項目(2013091)。

萬芳，女，本科，副主任技師，主要從事微生物檢驗技術(shù)與輸血管理研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.013

A

1672-9455(2015)10-1369-03

2014-11-05

2015-01-19)