循環microRNAs在糖尿病腎臟疾病診斷中的潛在價值*

韓 霜，臧素綱，陳 鑫，陳 曦 綜述；周玉貴△，汪曉鶯 審校(.南通大學附屬東臺醫院檢驗科，江蘇鹽城 400；.南通大學醫學院免疫學教研室，江蘇南通 600)

?

循環microRNAs在糖尿病腎臟疾病診斷中的潛在價值*

韓 霜1，臧素綱1，陳 鑫1，陳 曦1綜述；周玉貴1△，汪曉鶯2審校(1.南通大學附屬東臺醫院檢驗科，江蘇鹽城 224200；2.南通大學醫學院免疫學教研室，江蘇南通 226001)

循環microRNAs； 糖尿病腎臟疾病； 生物學標志物

糖尿病腎臟疾病(DKD)為糖尿病常見的慢性微血管并發癥之一，早期以腎小球系膜區增寬、細胞外基質集聚，微量蛋白尿為臨床特點，是糖尿病患者的重要死亡原因。目前腎活檢是腎臟疾病診斷金標準，但存在風險。非侵入性的診斷指標，以尿微量蛋白定量檢測為主，但其對DKD的診斷仍有一定局限性。眾多研究已證實，microRNAs不僅參與細胞生長、發育、分化、增殖、代謝、凋亡等一系列生理活動的調控，而且在DKD等多種疾病的病理過程中發揮著重要作用。近來，有研究發現microRNAs不僅存在于細胞內，也穩定地存在于血清、血漿、尿液、組織液等各類體液中，統稱為循環microRNAs[1]。本文就循環microRNAs在DKD診斷中的潛在價值作一綜述。

1 循環microRNAs概述

2008年，Mitchell等[2]、Chen等[3]、Gilad 等[4]學者幾乎同時報道了人血清、血漿中可檢出microRNAs。隨后，人的尿液、唾液、羊水、胸水、腦脊液及乳汁等其他體液中相繼被檢測到一定數量的microRNAs[5-6]。研究提示，循環microRNAs是以外泌體(exosome)或微囊泡(microvesicles)的形式包裹在磷脂雙分子膜內，通過細胞主動分泌釋放到血液中[7-8]。而組織損傷過程中釋放出來的循環microRNAs[9]，可能來自于壞死細胞的裂解和主動釋放等。與mRNA不同的是，循環microRNAs可以耐受環境中RNase的降解、極端pH、溫度、反復凍融、甲醛 浸泡等條件的影響[2-3，9-10]。

目前循環microRNAs檢測方法主要有基因芯片技術、Northern blot、高通量測序技術和實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。最常用的方法是qRT-PCR，此法特異性和靈敏度高，并且操作相對簡單。qRT-PCR主要是基于莖-環的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和基于poly(A)加尾的RT-PCR方法。這兩種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，但成本高，后者通用性好，適合推廣應用。近來，Lusi等[11]發現用電化學基因傳感器能夠更加簡便、快速地檢測循環microRNAs，靈敏度可達0.1 pmol/L。microRNAs檢測方法的發展進一步為循環microRNAs成為生物標志物提供了可能。

2 microRNAs與DKD

2.1 miR-192 Kato等[12]發現鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠模型腎小球中轉化生長因子β1(TGF-β1)和miR-192表達水平均增高，體外實驗以TGF-β刺激系膜細胞亦可出現miR-192水平增高。進一步研究發現，TGF-β能抑制Smad 作用蛋白-1(SIP1)和E-box抑制因子(δEF1)的表達，使得Ⅰ型膠原 (ColⅠ)合成增加。而SIP1基因的3′UTR是miR-192的作用靶點，miR-192可抑制SIP1的表達，敲除SIP1基因能阻斷TGF-β1介導的鈣黏蛋白(cadherin)下調。以上研究證實，TGF-β可通過miR-192下調SIP1和δEF1，從而增加Ⅰ型膠原α2鏈(Col1a2)的表達，介導腎臟纖維化的發生。Krupa 等[13]研究表明，腎小管上皮細胞中miR-192的降低或缺失能夠促進腎臟纖維化的發展。通過對不同分期DKD患者腎活檢組織microRNAs的檢測，發現晚期DKD腎小管上皮細胞中miR-192顯著降低，miR-192的低表達與腎小管間質纖維化和腎小球濾過率相關。體外實驗也證實，經TGF-β處理過的腎小管上皮細胞中miR-192 呈低表達水平。因此，腎小管上皮細胞中miR-192的缺乏和丟失是導致腎纖維化一個重要的因素。近來，李潔等[14]應用qRT-PCR法，發現DKD患者血清miR-192表達降低。生物信息分析法預測靶基因分析發現，TGF-β信號通路下游基因抗鋅指E盒結合蛋白1(ZEB-1)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)和Col I可被miR-192調節。體外實驗證實，不同濃度TGF-β刺激均導致系膜細胞及培養上清miR-192水平顯著下降。

2.2 miR-21 Zhang等[15]的研究首次提供證據表明，miR-21與早期DKD的潛在作用。體內和體外實驗均顯示在早期miR-21是下調的。在糖尿病db/db小鼠模型中，miR-21的過度表達抑制了系膜細胞的增殖、降低了24 h尿蛋白排泄率。此研究還證實，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN 10)為miR-21的靶基因，在miR-21處理過的腎小球系膜細胞和糖尿病db/db小鼠體內，磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)的水平是增加的。研究表明miR-21通過特異性靶向調控PTEN/PI3K信號傳導途徑，以抑制腎小球系膜增生，提示miR-21可能是一個新的DKD保護因子，可成為早期DKD中一個新的防治靶標。Dey等[16]發現在OVE26 1型糖尿病小鼠的腎皮質中miR-21顯著上升，PTEN編碼的腫瘤抑制蛋白減少，纖維連接蛋白(Fn)水平增加。過表達的miR-21還可增加AKT磷酸化。相反，miR-21海綿體的表達則抑制上述過程的發生。此外，miR-21 還抑制PRAS40(Proline-rich-Akt Substate，40 kDa)活性使得TOR復合體1(TORC1)活性增強，導致腎細胞肥大和Fn增多。曾健英等[17]應用qRT-PCR方法檢測2型DKD患者血漿miR-21，并作ROC曲線分析，發現2型DKD患者血漿中miR-21較對照組顯著增高，ROC曲線下面積達0.822，提示檢測血漿中miR-21的水平將為DKD的早期腎小管功能受損的診斷和臨床腎功能受損情況的評估提供更敏感、可靠的指標，有利于DKD的早期診斷和早期干預治療。

2.3 miR-377 Wang等[18]研究表明，在自發性和STZ誘導糖尿病腎病小鼠模型的腎皮質組織以及高糖刺激的人系膜細胞和原代小鼠系膜細胞中，miR-377表達明顯升高。實驗證實，系膜細胞miR-377的過度表達可抑制與DKD相關基因表達進而增加Fn的合成。發生DKD時，過表達的miR-377通過抑制p21依賴性激酶(PAK1)和超氧化物歧化酶(SOD)的表達，間接促使Fn產生，導致細胞外基質蛋白過度積累，進而引起DKD的發生、發展。

2.4 其他相關microRNAs Kato等[19]證實高糖環境下培養人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)mi-29a表達下調。Long 等[20]在db/db 小鼠活體腎小球及體外高濃度葡萄糖處理的腎臟微血管內皮細胞和足細胞中，發現miR-29c 可介導細胞外基質蛋白的積累。國內楊陽等[21]人通過實時定量PCR技術發現，DKD患者血清中miR-93下調，可能通過調控其下游靶基因在DKD發生過程中起重要作用。Argyropoulos等[22]應用qRT-PCR法檢測40例病程大于20年的Ⅰ型DKD患者尿液中的microRNAs，發現27種(miR-524，miR-429，miR-552，miR-433等)尿液microRNAs在Ⅰ型DKD的不同階段表達量不同。

3 小 結

目前，DKD診斷主要是基于循環中一些蛋白質表達水平的改變，但蛋白質組成的復雜性、轉錄后修飾引起的變異、標本的穩定性等在一定程度上限制了其診斷價值。循環miRNAs 的發現，彌補了蛋白質標志物的不足，特異性強、穩定性好且樣本易獲取，但其在DKD中的臨床應用仍面臨一定的挑戰。首先，目前初步研究表明有多種miRNAs 在DKD的發生和發展中發揮重要調節作用，然而循環microRNAs在DKD中的作用機制尚未完全闡明，它們與其他基因表達調控因子組成的復雜調節網絡及相互作用機制有待進一步研究，僅采用一種或幾種microRNAs作為診斷指標可能特異性不夠。其次，DKD相關microRNAs部分研究結果、結論不一致的原因尚不十分清楚，但糖尿病的類型及發展階段，動物模型，細胞類型，標本類型，小樣本量，實驗方法，實驗條件等均有可能是重要因素。

現階段microRNAs在DKD中的研究以動物模型和體外實驗為主，相信隨著microRNAs在DKD中的作用機制及臨床意義的進一步闡明，循環microRNAs必將成為DKD診斷及預后判斷的重要新型無創性生物學標志物，也將為DKD的靶向治療提供新的途徑。

[1]Reid G，Kirschner MB，van Zandwijk N.Circulating microRNAs:association with disease and potential use as biomarkers[J].Crit Rev Oncol Hematol，2011，80(2):193-208.

[2]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513-10518.

[3]Chen X，Ba Y，Ma LJ，et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res，2008，18(10):997-1006.

[4]Gilad S，Meiri E，Yogev Y，et al.Serum MicroRNAs are promising novel biomarkers[J].PLOS One，2008，3(9):e3148.

[5]Cogswell J P，Ward J，Taylor IA，et al.Identification of miRNA changes in Alzheimer′s disease brain and CSF yields putative biomarkers and insights into disease pathways [J].J Alzheimer′s Dis，2008，14(1):27.

[6]Zubakov D，Boersma AW，Choi Y，et al.MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J].Int J Legal Med，2010，124(3):217-226.

[7]Hunter MP，Ismail N，Zhang XL，et al.Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles [J].PLOS One，2008，3(11):e3694.

[8]Corsten MF，Dennert R，Jochems S，et al.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease[J].Cir Cardiovasc Genet，2010，3(6):499-506.

[9]Kroh EM，Parkin RK，Mitchell PS，et al.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)[J].Methods (San Diego，Calif.)，2010，50(4):298-301.

[10]Ciesla AM，Skrzypek K，Kozakowska MA，et al.MicroRNAs as biomarkers of disease onset[J].Anal Bioanal Chem，2011，401(7):2051-2061.

[11]Lusi EA，Passamano M，Guarascio P，et al.Innovative electrochemical approach for an early detection of microRNAs[J].Anal Chem，2009，81(7):2819-2822.

[12]Kato M，Zhang J，Wang M，et al.MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors[J].Proc Nat Acad Sci U S A，2007，104(9):3432-3437.

[13]Krupa A，Jenkins R，Luo DD，et al.Loss of MicroRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2010，21(3):438-447.

[14]李潔，周平，胡秀梅，等．糖尿病腎病患者血清miR-192的表達及其對轉化生長因子β信號通路的影響[J]．中華腎臟病雜志，2012，28(5)：388-391．

[15]ZhangZ，PengHM，ChenJX，etal.MicroRNA-21protectsfrommesangialcellproliferationinducedbydiabeticnephropathyindb/dbmice[J].FEBSLetters，2009，583(12):2009-2014.

[16]Dey N，Das F，Mariappan MM，et al.MicroRNA-21 orchestrates high glucose-induced signals to TOR complex 1，resulting in renal cell pathology in diabetes[J].J Biol Chem，2011，286(29):25586-25603.

[17]曾健英，何鳳，童俊容，等．三種血清微小RNA的檢測在糖尿病腎病診斷中的價值評估[J]．新醫學，2012，43(8)：531-533．

[18]Wang Q，Wang Y，Minto AW，et al.MicroRNA-377 is up-regulated and can lead to increased fibronectin production in diabetic Rephropathy[J].FASEB J，2008，22(1)：4126-4135.

[19]Kato M，Natarajan R.microRNA cascade in diabetic kidney disease:Big impact initiated by a small RNA[J].Cell Cycle,2009,8(22):3613-3614.

[20]Long JY，Wang Y，Wang WJ，et al.MicroRNA-29c is a signature MicroRNA under high glucose conditions that targets sprouty homolog 1，and its in vivo knockdown prevents progression of diabetic nephropathy[J].J Biol Chem，2011，286(13):11837-11848.

[21]楊陽，張運津，謝安，等．糖尿病腎病患者血清miRNA-93的表達變化及意義[J]．實驗與檢驗醫學，2012，30(3)：222-224．

[22]Argyropoulos C，Wang K，Mcclarty S，et al.Urinary microRNA profiling in the nephropathy of type 1 diabete[J].PLOS One，2013，8(1):54662.

醫學統計工作的基本內容

按工作性質及其先后順序，可將醫學統計工作分為實驗設計、收集資料、整理資料、分析資料。實驗設計是開展某項醫學研究工作的關鍵，包括醫學專業設計和統計學設計，醫學專業設計的內容包括研究對象納入和排除標準、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測)指標、統計方法等。收集資料的方法包括各種試驗、檢測或調查，要求資料完整、準確、及時、有足夠數量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對、對資料進行分組與匯總等。分析資料即對資料進行統計學分析，包括進行統計描述和統計推斷。

江蘇省鹽城市醫學科技發展計劃項目(YK20130103)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.058

A

1672-9455(2015)10-1464-02

2014-12-16

2015-02-18)

△通訊作者，E-mail:yugui_z@163.com。