SNAREs蛋白復合物與囊泡融合分子調節機制的研究進展*

陳立強，王洋洋，司艷輝 綜述；梁潔玲，李海珠 審校(廣東省肇慶市第一人民醫院：.檢驗科；.血液內科 56060)

?

SNAREs蛋白復合物與囊泡融合分子調節機制的研究進展*

陳立強1，王洋洋1，司艷輝2綜述；梁潔玲1，李海珠1審校(廣東省肇慶市第一人民醫院：1.檢驗科；2.血液內科 526060)

SNAREs； 囊泡融合； Synaptobrevins； Syntaxins； 突觸相關蛋白

細胞內大分子物質及顆粒性物質不能自由穿過細胞膜，必須以囊泡運輸的方式進行跨膜轉運，囊泡介導的轉運方式，無論是正向或是逆向轉運，都包括3個主要步驟，分別是外殼蛋白的選擇，囊泡的出芽與形成和轉運物質的選擇[1]。研究表明在囊泡運輸過程中N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNAREs)發揮著重要作用，自從SNAREs蛋白復合物被發現，它就作為細胞膜融合的關鍵組分而被廣泛深入研究[2]；現將SNAREs蛋白復合物與囊泡融合分子調節機制研究的最新進展進行綜述。

1 SNAREs核心蛋白的分子結構與功能

SNARE復合物指的是N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體復合物，其由4個七肽重復序列的SNARE結構組成的螺旋形結構體[3-4]，其中3個SNARE結構體會在細胞膜的特定位置進行錨定位，形成膜與膜之間的結合位點，被稱為定位-SNARE復合物(target-SNARE或t-SNARE)；而第4個SNARE結構體可錨定在需要融合的膜上，稱為囊泡-SNARE復合物(vesicle-SNARE或v-SNARE)，膜融合過程需要一系列如Synaptobrevins、Syntaxins 和突觸相關蛋白等SNAREs核心蛋白的分子的協同作用共同完成[5-6]。

1.1 Synaptobrevins SNARE蛋白的氨基酸序列和胞吐作用已經得到廣泛的研究，其中v-SNARE Synaptobrevins蛋白是由一組相對分子質量為19×103的小分子蛋白組成，其參與Ca2+依賴的囊泡融合作用。Synaptobrevins蛋白通過其C-末端跨膜結構域促進SNARE的“拉鏈樣結合”反應而實現囊泡融合[7]。Synaptobrevins蛋白可被血清型為B、D、F和G的肉毒桿菌神經毒素(肉毒毒素)裂解而失去生物學作用，造成胞吐作用受到抑制。Synaptobrevins 1和2在真核細胞均有表達，例如在神經肌肉接頭、感覺細胞(如毛細胞等)和光感受器等，Synaptobrevins蛋白缺乏會使囊泡分泌功能嚴重受損以及完全抑制由Ca2+誘導的囊泡分泌作用[8-9]。

1.2 Syntaxins Syntaxins 是鑲嵌于胞膜的t-SNARE跨膜蛋白，在膜融合過程和Ca2+誘導的胞吐過程中，不同的Syntaxins 蛋白功能結構域在融合過程的各環節都發揮著重要作用。Syntaxins 具有單一的跨膜區結構域和胞內組成的SNARE復合體結構域(H3)和調節結構域(Habc)[10]。Syntaxin 蛋白的核心結構域由特定的synaptobrevin和SNAP-25蛋白復合體組成；最近的研究表明，Syntaxin 可被神經毒素BoNT/C裂解，而抑制了Ca2+誘導的神經元細胞和神經內分泌細胞分泌神經遞質。Habc 結構域是由3個α-螺旋折疊形成的一個封閉蛋白結構，在囊泡融合過程中封閉結構會解開而暴露SNARE結構域。Syntaxin 與一系列融合調節蛋白相互作用，例如synaptotagmin，Ca2+通道蛋白和存在于毛細胞的otoferlin蛋白，對胞膜融合起到精細的調節作用[11]。Syntaxin 1A和syntaxin 1B是大腦中主要的syntaxin 異構體，但syntaxins 3和3A主要存在于神經分泌細胞和視網膜細胞中；哺乳動物毛細胞表達syntaxin 1A和syntaxin 3，然而毛細胞SNARE復合物的分子確切機制還有待深入研究[12]。

1.3 突觸相關蛋白(SNAP) SNAP是廣泛表達于原核和真核生物中的t-SNARE，在膜融合過程中起著重要作用。SNAP是缺乏跨膜結構域的胞質蛋白，其通過位于中心分子的棕櫚酰側鏈半胱氨酸殘基形成的硫酯鍵附著于突觸前膜上，SNAP-25的兩個蛋白螺旋結構是SNARE核心復合體的組成部分，在鈣觸發的胞吐作用中發揮重要作用[13-14]。研究表明SNAP-25基因敲除小鼠的鈣觸發胞吐作用嚴重受損，表明SNAP-25在神經分泌的重要性；肉毒桿菌神經毒素BoNT/A可裂解SNAP-25，使t-SNARE形成陷阱，從而抑制胞吐作用。SNAP-23與SNAP-25是同源異構體，是突觸后膜谷氨酸受體蛋白的組成部分，這兩個SNAP亞型是通過棕櫚酰側鏈連接到胞膜上；然而它們對肉毒毒素的敏感性不同，SNAP-25的可被肉毒毒素BoNT/A，C和E裂解，而SNAP-23被肉毒毒素BoNT/A和E裂解[15-16]。

2 SNAREs在囊泡融合中的作用

SNAREs通過其穩定存在的三分子結構來連接囊泡膜和細胞膜，三個分子結構各由約60個氨基酸組成，其一是由synaptobrevin蛋白和syntaxin 蛋白組合而成，另外兩個由SNAP-25組合構成的。SNAREs復合體精細的分子結構通過許多平行排列的α-蛋白螺旋結構相互纏繞，形成一個“亮氨酸拉鏈樣”的嵌入式結構，該結構外周由1個亮氨酸殘基和3個谷氨酰胺殘基組合而成的重復模塊組件[17-18]。嵌入式結構延伸進入胞膜脂質雙層，參與囊泡膜融合體的形成。“亮氨酸拉鏈樣”嵌入式結構的相互連接，促使囊泡和細胞膜之間互相靠近，連接結構的構象改變與syntaxin 和synaptobrevin蛋白特定結構氨基酸序列改變在囊泡融合中起到關鍵作用[19-20]。

SNARE的兩個結構域通過跨膜結構域錨定在相互融合的兩膜上，而t-SNARE和v-SNARE的介導使連接的兩膜在特定的位置發生融合作用[21]。絕大多數t-SNARE復合體在螺旋束的中心位置都含有相對保守的谷氨酰胺序列，稱為“Q-SNARE蛋白”，而在v-SNARE的這個位置含有的是精氨酸序列，稱為“R-SNARE蛋白”。所有的SNARE復合物在膜融合的過程中產生催化功能，不同類型SNARE復合物在不同的膜轉運過程中發揮作用[22-23]。大量研究表明SNARE復合物參與酵母細胞內膜系統轉運過程，包括那些參與內質網到高爾基體，高爾基體到囊泡，高爾基體到細胞膜轉運和同型液泡融合等，大多數的酵母或哺乳動物的SNARE同源基因的功能相似[24]。酵母含有5種R-SNAREs (Snc 1p，Snc 2p，Nyv 1p，Sec22p和Ykt 6p)，而哺乳動物細胞中含有至少10種(包括VAMPs 1，2，3，4，5，7，8，sec22b，ykt 6和tomosyn[25]。因此，R-SNAREs對哺乳動物細胞膜轉運過程和協調哺乳動物生理功能起關鍵作用。在某些情況下，多細胞生物完成正常生理功能需要專門的膜結構，而在這些膜結構之間轉運需要特定的SNAREs，稱為組織特異性SNAREs。例如組織特異性SNAREs(包括syntaxin 1A，SNAP-25和VAMP 2)能調節哺乳動物細胞囊泡的胞吐作用，而在酵母中沒有同源蛋白的表達[26]。VAMP 5，屬于質膜SNARE，主要是在肌肉細胞中，在誘導肌肉收縮過程中發揮作用。此外，syntaxin 17主要在于類固醇激素合成細胞的滑面內質網中表達，而syntaxin 11在免疫系統的特定轉運過程中發揮重要角色[27]。

3 小 結

SNAREs蛋白復合物在囊泡融合中起到核心的作用，亮氨酸拉鏈模式是詮釋囊泡融合機制最有代表性的解說，然而其機制有待進一步的完善。對SNARE蛋白及其調控因素的研究，有利于更加深入了解SNAREs蛋白復合體調節囊泡融合未知的相關機制，從而為揭示囊泡融合過程提供可靠地科學依據。

[1]Yany L,Dun AR,Martin KJ,et al.Secretory vesicles are preferentially targeted to areas of low molecular SNARE density[J].PLOS One,2012,7(11):e49514.

[2]Kato N,Expression BH.Localization and interaction of SNARE proteins in arabidopsis are selectively altered by the dark[J].Plant Signal Behav,2010,5(11):1470-1472.

[3]Wesolowski J,Paumet F.SNARE motif:a common motif used by pathogens to manipulate membrane fusion[J].Virulence,2010,1(4):319-324.

[4]Brewer KD,Li W,Horne BE,et al.Reluctance to membrane binding enables accessibility of the synaptobrevin SNARE motif for SNARE complex formation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(31):12723-12728.[5]Lobingier BT,Merz AJ.Sec1/Munc 18 protein Vps 33 binds to SNARE domains and the quaternary SNARE complex[J].Mol Biol Cell,2012,23(23):4611-4622.

[6]Cheng KK,Lam KS,WU Dong-hai,et al.APPL1 potentiates insulin secretion in pancreatic beta cells by enhancing protein kinase Akt-dependent expression of SNARE proteins in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(23):8919-8924.

[7]Alpadi K,Kulkarni A,Comte V,et al.Sequential analysis of Trans-SNARE formation in intracellular membrane fusion[J].PLOS Biol,2012,10(1):e1001243.

[8]Nair U,Jotwani A,Geng JF,et al.SNARE proteins are required for macroautophagy[J].Cell,2011,146(2):290-302.

[9]Vrljic M,Strop P,Ernst JA,et al.Molecular mechanism of the Synaptotagmin-Snare interaction in Ca2+-Triggered vesicle fusion[J].Nat Struct Mol Biol,2010,98(3):325-331.

[10]Sudhof TC,Rizo J.Synaptic vesicle exocytosis[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(12):112-115..

[11]Gao Y,Zorman S,Gundersen G,et al.Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages[J].Science,2012,337(610):1340-1343.

[12]Reverter M,Rentero C,Vila de Muga SA,et al.Cholesterol transport from late endosomes to the Golgi regulates t-SNARE trafficking,assembly,and function[J].Mol Biol Cell,2011,22(21):4108-4123.

[13]Hernandez JM,Stein A,Behrmann EA,et al.Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex[J].Science,2012,336(688):1581-1584.

[14]Murray DH,Tamm LK.Molecular mechanism of cholesterol-and Polyphosphoinositide-Mediated syntaxin clustering[J].Biochemistry,2011,50(42):9014-9022.

[15]Diao JJ,Su ZL,Ishitsuka Y,et al.A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion[J].Nat Commun,2010,1(1):54.

[16]Morgera F,Sallah MR,Dubbke ML,et al.Regulation of exocytosis by the exocyst subunit Sec6 and the SM protein Sec1[J].Mol Biol Cell,2012,23(2):337-346.

[17]Xia T,Tong J,Rathore SS,et al.Network motif comparison rationalizes Sec1/Munc 18-SNARE regulation mechanism in exocytosis[J].BMC Syst Biol,2012,6(1):19.

[19]Meijer M,Burkhardt P,de Wit H,et al.Munc 18-1 mutations that strongly impair SNARE-complex binding support normal synaptic transmission[J].EMBO J,2012,31(9):2156-2168.

[20]Fraldi A,Annunziata F,Lombardi AA,et al.Lysosomal fusion and SNARE function are impaired by cholesterol accumulation in lysosomal storage disorders[J].EMBO J,2010,29(21):3607-3620.

[21]Lorentz A,Baumann A,Vitte J,et al.The SNARE Machinery in Mast Cell Secretion[J].Front Immunol,2012,3:143.

[22]Wu Y,Gu YW,Morphew MK,et al.All three components of the neuronal SNARE complex contribute to secretory vesicle docking[J].J Cell Biol,2012,198(3):323-330.

[23]Boswell KL,James DJ,Esquibel JM,et al.Munc 13-4 reconstitutes calcium-dependent SNARE-mediated membrane fusion[J].J Cell Biol,2012,197(2):301-312.

[24]Domanska MK,Kiessling V,Tamm LK.Docking and fast fusion of synaptobrevin vesicles depends on the lipid compositions of the vesicle and the acceptor SNARE Complex-Containing target membrane[J].Biophysical J,2010,99(9):2936-2946.

[25]Liu W,Parpura V.SNAREs:could they be the answer to an energy landscape riddle in exocytosis[J].Scientific World Journal,2010,10(3):1258-1268.

[26]van den Bogaart G,Holt MG,Bunt GA,et al.One SNARE complex is sufficient for membrane fusion[J].Nat Struct Mol Biol,2010,17(3):358-360.

[27]Khodthong C,Kabachinski G,James DJ.Munc 13 homology domain-1 in CAPS/UNC31 mediates SNARE binding required for priming vesicle exocytosis[J].Cell Metabolism,2011,14(2):254-263.

[28]Ramakrishnan NA,Drescher MJ,Drsecher DG.The SNARE complex in neuronal and sensory cells[J].Mol Cell Neurosci,2012,50(1):58-69.

廣東省科技廳產業技術研究與開發資金計劃項目資助(2012B031800498)；廣東省肇慶市科技創新計劃項目資助(2012E284)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.057

A

1672-9455(2015)10-1462-02

2014-11-15

2015-02-18)