甲酸混合酸脫鈣液在兔股骨頭制片中的應(yīng)用*

周正麗，湯華軍，王 云(瀘州醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，四川瀘州 646000)

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甲酸混合酸脫鈣液在兔股骨頭制片中的應(yīng)用*

周正麗，湯華軍，王 云(瀘州醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，四川瀘州 646000)

目的 觀察甲酸混合酸脫鈣液對股骨頭組織的制片效果。方法 采用成年新西蘭大白兔10只，切斷股骨頭圓韌帶，取股骨上1/3段置于甲酸混合酸脫鈣液中脫鈣1周，隨即常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備5 μm厚縱切片，行HE染色。結(jié)果 所有組織切片厚薄均勻，未見脫片現(xiàn)象，股骨頭完整性較好，各層次分明，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)清晰，著色鮮艷。結(jié)論 選用甲酸混合酸脫鈣液制片股骨頭組織具有脫鈣時間相對較短、操作簡單、組織結(jié)構(gòu)完整、染色效果較好的特點(diǎn)。

股骨頭； 兔； 脫鈣

股骨頭壞死是骨關(guān)節(jié)外科常見難疾，動物模型實(shí)驗(yàn)研究是當(dāng)前股骨頭壞死研究的熱點(diǎn)之一[1-2]，通過組織病理切片評估股骨頭病變的進(jìn)程是股骨頭壞死檢查的金標(biāo)準(zhǔn)，而股骨頭組織由于其硬度較大，易脫片、易破碎、染色不佳等常使制片效果不盡如人意，其中脫鈣液的選擇是影響制片效果的關(guān)鍵。故本文選擇股骨頭壞死常備實(shí)驗(yàn)動物--經(jīng)濟(jì)實(shí)用性健康兔為制片對象，擬采用甲酸混合酸脫鈣液制作切片以觀察其制片效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年新西蘭大白兔10只，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，本研究所采用的動物實(shí)驗(yàn)操作程序符合動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器 試劑包括生理鹽水、戊巴比妥鈉、甲酸、濃鹽酸、三氯化鋁、甲醛、石蠟、蘇木精染液、伊紅染液、甘油、二甲苯等。實(shí)驗(yàn)儀器磁力攪拌器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，熱恒溫電烤箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，RM 2235石蠟切片機(jī)(Leica)，YS100光學(xué)顯微鏡(Nikon)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材 以3%戊巴比妥鈉 30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉動物；依次切開皮膚、淺筋膜，鈍性分離各層臀肌，切開髖關(guān)節(jié)囊，切斷股骨頭韌帶，顯露股骨頭，選擇骨干1/3處將股骨鋸斷，在低溫冰塊上迅速剔除股骨附著的肌肉及結(jié)締組織，將其置于10%甲醛中固定48 h。

1.3.2 甲酸混合酸脫鈣液的配置 取甲酸5 mL，濃鹽酸8.5 mL，稱量三氯化鋁7 g，混勻后加蒸餾水定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 股骨頭組織切片的制作 將標(biāo)本置于甲酸混合酸脫鈣液中，磁力攪拌器攪拌混勻，靜置脫鈣1周，之后以大轉(zhuǎn)子為中心，縱行剖開股骨頭，常規(guī)脫水、透明，隨即石蠟包埋，采用石蠟切片機(jī)制備5 μm厚縱切片，行HE染色。

2 結(jié) 果

所有組織切片厚薄均勻，無刀痕，均未見脫片現(xiàn)象，肉眼可見切片股骨頭完整性較好，軟骨區(qū)、骨小梁區(qū)、骺板區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，層次分明。光學(xué)顯微鏡下可見骨小梁結(jié)構(gòu)完整，無折疊；軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)清晰可見，細(xì)胞核無明顯收縮現(xiàn)象，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)著色清晰，紅藍(lán)相間，色彩鮮艷；脂肪細(xì)胞、小血管等結(jié)構(gòu)分明，色澤鮮明。見圖1、2。

圖1 軟骨細(xì)胞，HE染色 40×10倍

圖2 骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，HE染色 40×10倍

3 討 論

脫鈣是指用物理或化學(xué)方法將骨組織標(biāo)本中的有機(jī)組織和鈣鹽分離，通過去除鈣鹽和無機(jī)鹽從而獲得完整的膠原纖維組織，只有去除無機(jī)鹽物質(zhì)，才能使組織軟化行切片染色觀察[3]，可見股骨頭組織制片脫鈣液的選擇是制片成功的關(guān)鍵。脫鈣若不徹底，鈣鹽遺留，切片易破碎、殘缺，影響制片的質(zhì)量；脫鈣過度，則脫鈣液中的酸類物質(zhì)又會損傷組織中的抗原，破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致染色效果不佳。

目前，骨組織切片常選用的脫鈣液包括以硝酸為主的酸性脫鈣液和乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液。硝酸盡管具有脫鈣能力強(qiáng)、時間短等優(yōu)點(diǎn)，但易出現(xiàn)脫鈣過度，細(xì)胞明顯腫脹至使細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核染色能力減弱，返藍(lán)困難而至細(xì)胞核呈淡紅色，對比度明顯降低[4]。EDTA是一種優(yōu)良的脫鈣螯合劑，對組織破壞極小，能保持組織細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，尤其細(xì)胞顯微化學(xué)改變甚微，且能保存組織中的抗原物質(zhì)和某些酶類的活性，但EDTA脫鈣液脫鈣作用較緩慢，短者數(shù)周常者數(shù)月，不適用于大面積骨組織脫鈣[5]。

本研究選用甲酸混合酸脫鈣液輔以三氯化鋁，其中甲酸對組織的破壞程度較輕，脫鈣時間范圍寬松；鹽酸可明顯增加脫鈣速度，而且對組織具有收縮作用；三氯化鋁的加入，鋁離子易被吸附的特性可以起到保護(hù)劑的作用，從而減緩鹽酸對細(xì)胞核著色的影響，同時它又是HE染色蘇木精的媒染助染劑，可輔助得到優(yōu)良的染色效果。且甲酸混合酸脫鈣液脫鈣時間僅1周，脫鈣中間不換液，不水洗，組織損傷較少，即可保證脫鈣徹底，又可使各結(jié)構(gòu)層次不分離，取得良好的染色效果。此外，還發(fā)現(xiàn)脫鈣后充分水洗也是影響制片成功的因素之一，組織脫鈣后經(jīng)流動的自來水充分沖洗，自來水的弱堿性可中和殘留在組織中的脫鈣液酸性，有利于切片的蘇木素著色。

綜上所述，甲酸混合酸脫鈣液輔以三氯化鋁對骨組織標(biāo)本脫鈣有一定的優(yōu)越性，值得在臨床實(shí)驗(yàn)中使用。

[1]Poignard A，Lebouvier A，Cavet MA，et al.New preclinical porcine model of femoral head osteonecrosis to test mesenchymal stromal cell efficiency in regenerative medicine[J].Int Orthop，2014，38(9):1837-1844.

[2]Hwang Y，Park J，Choi SH，et al.Traumatic and Non-traumatic osteonecrosis in the Femoral Head of a Rabbit Model[J].Laboratory Animal Research，2011，27(2):127-131.

[3]戚亦萍，吳明媛，王明海，等．兔膝關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)組織切片的制備方法[J]．上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2009，27(3)：314-317．

[4]羅燦嶠，莫木瓊，鐘覺民．不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應(yīng)用[J]．中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，6(19)：27-28．

[5]沈溪明，何欣欣，吳東霞，等．不同濃度和pH值EDTA脫鈣液對下頜骨免疫組化結(jié)果的影響[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30(6)：696-698．

瀘州醫(yī)學(xué)院校級課題 (2013ZRQN073)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.038

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1672-9455(2015)10-1426-01

2014-11-05

2015-02-05)