免疫透射比濁法在AU5800全自動生化分析儀檢測降鈣素原的方法學評價

戴婉如，周 歡，林燕輝，伍嚴安(福建醫科大學省立臨床醫學院檢驗科，福州 300001)

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免疫透射比濁法在AU5800全自動生化分析儀檢測降鈣素原的方法學評價

戴婉如，周 歡，林燕輝，伍嚴安(福建醫科大學省立臨床醫學院檢驗科，福州 300001)

目的 在AU5800全自動生化分析儀上用免疫透射比濁法檢測降鈣素原(PCT)的方法學評價。方法通過AU5800全自動生化分析儀來檢測PCT的精密度、線性、參考區間等指標，并與酶免疫熒光法試劑盒進行相關性比較，從而評價其性能。結果 該方法批內和批間精密度分別小于8%和15%；0～80 ng/mL范圍內線性良好(Y=0.994 1X+0.124 5，R2=0.999)；正常人群的參考范圍為小于0.5 ng/mL；與酶免疫熒光法的相關性良好(Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7)。結論 本檢測方法不僅實現了PCT檢測的快速、全自動化，而且化學性能優良、操作簡單，降低了臨床試劑成本，適合臨床推廣使用。

降鈣素原； 免疫比濁法； 方法學評價； 免疫熒光法

降鈣素原(PCT)在臨床主要應用于感染性疾病的鑒別[1]，是診斷血行感染、菌血癥、敗血癥的一個較好指標[2-3]。目前PCT的檢測方法主要有放射免疫法、雙抗體夾心法、膠體金法、免疫熒光法、免疫透射比濁法等。本研究選用的國產免疫透射比濁法，具有快速、簡便，且價格相對較低廉的特點。根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)和醫學實驗室認可標準(ISO15189)對實驗室質量的要求[4]，實驗室對檢測系統(儀器、試劑、校準品等)必須進行性能驗證[5]。因此，實驗室需要對廠商聲明的主要分析性能進行驗證。本文對AU5800檢測系統測定PCT進行精密度、線性范圍、參考區間等指標的方法學評價，再與酶免疫熒光法檢測結果進行比對，觀察結果相關性，以此來評價該檢測方法在臨床上的價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源 患者標本為2013年10～11月實驗室接收的67例臨床送檢標本。酶免疫熒光法隨時檢測送檢標本，剩余血清-80 ℃保存用于免疫比濁法測試(一次性完成)。正常人群均為健康體檢者，年齡16～77歲，選擇血常規、C反應蛋白(CRP)正常，即無急、慢性炎癥的體檢合格標本20例。

1.2 儀器與試劑 貝克曼AU5800全自動生化分析儀，梅里埃全自動熒光分析儀。安徽大千生物工程有限公司生產的PCT測定試劑盒(免疫透射比濁法)(批號085813)，標準品(批號084113)和質控品(批號084213)。梅里埃診斷產品(上海)有限公司進口的PCT測定試劑盒(酶免疫熒光法)(批號1002326640)，校準品(批號1057790)和質控品(批號1057880)。

1.3 方法

1.3.1 免疫透射比濁法 樣品中的PCT與試劑中的PCT抗體發生抗原-抗體反應，形成復合物，從而引起透光度減低，在一定范圍內與樣本中PCT量呈線性相關。

1.3.2 酶免疫熒光法 結合一步免疫測定夾心法和最終熒光檢測來進行測定。

1.4 評價標準

1.4.1 精密度評價 按照CLSI EP15-A2，取2個濃度水平質控品，5 d實驗，每天做1批，每批每個水平3次重復測定，計算批內精密度和批間精密度的均值、標準差和變異系數。

1.4.2 線性評價 選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標本各1份，濃度覆蓋儀器說明書給出的線性范圍，H和L按等比關系配制形成系列濃度血清(如1L，0.8L+0.2H，0.6L+0.4H，0.4L+0.6H，0.2L+0.8H，1H)。每個實驗樣品在檢測系統上重復測定2次，記錄結果。將實測值與預期值作比較。采取平均斜率來確定系列樣品應含有的待測物的預期值(X)，所有樣品重復測定的均值為實測值(Y)，將所有結果點在X-Y坐標圖上，計算回歸方程:Y=bX+a和R2，并用t檢驗驗證a是否與0差異有統計學意義。

1.4.3 參考區間評價 參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人標本，在檢測系統上進行測定，對結果進行統計并對儀器說明書提供的參考區間進行驗證，若20份標本檢測結果均在儀器說明書提供的參考區間內或僅有2個標本超出，則驗證通過。否則，進行參考區間確立實驗。

1.4.5 相關性評價 通過67例不同病例分別用酶免疫熒光法和免疫透射比濁法測定，比較兩者的相關性。

1.5 統計學處理 實驗數據采用SPSS13.0軟件和Microsoft Excel 2000軟件進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCT精密度結果 精密度評價結果符合廠家聲明的批內精密度CV≤8.0%、批間精密度CV≤15.0%。該檢測系統的批內精密度和批間精密度均滿足檢測要求。見表1。

表1 PCT的精密度

2.2 線性結果R2=0.999，b=0.994 1，1.03≥b≥0.97；a=0.124 5，經t檢驗t=0.371，小于t0.05=2.228，顯示a與0差異無統計學意義(P>0.05)。驗證結果表明PCT在0～58.8 ng/mL范圍內具有良好線性關系，與廠家提供線性范圍0～80 ng/mL相符合。見表3和圖1。

表3 6個稀釋濃度標本PCT結果(ng/mL)

注:X為各組數據的理論值，Y為各組實測值減去“1”號實測均值后的數值(實測值)。

圖1 PCT的線性測定

2.3 參考區間的驗證 參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人血清標本，在檢測系統上進行測定。經驗證20份健康人血清標本濃度均在儀器說明書提供的參考區間內，符合試劑說明書提供參考范圍，無結果超出所驗證的參考范圍，參考范圍通過驗證，表明正常人群PCT參考范圍為小于0.5 ng/mL。

2.4 相關性實驗 取67例標本同時用酶免疫熒光法和免疫透射比濁法測定，結果表明兩者相關性良好，Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7。見圖2。

圖2 免疫比濁法和免疫熒光法檢測PCT結果比對

3 討 論

根據醫學實驗室認可標準(ISO15189)對實驗室質量的要求，實驗室對檢測系統(儀器、試劑、校準品等)必須進行驗證。對試劑驗證包括：精密度、線性、準確度和參考范圍等[6]。

精密度評價按照CLSI EP15-A2文件進行，實驗數據顯示在AU5800全自動生化分析儀上PCT測定的精密度達到了廠家檢測聲明，批內和批間精密度分別小于8%和15%。線性評價即分析測量范圍評價根據EP6-A文件，采用簡便的平均斜率法。在AU5800全自動生化分析儀上PCT的濃度在0～58.8 ng/mL范圍內具有良好線性關系，由于PCT達到80 ng/mL的血清標本難以獲得，最高檢測限58.8 ng/mL偏低于廠家的最高測定值，有待于進一步驗證。參考區間的驗證參考NCCLSC28-A2文件，選擇20份體檢合格的健康人血清標本全部通過驗證。與法國梅里埃診斷產品(上海)有限公司進口的PCT測定試劑盒(酶免疫熒光法)進行相關性實驗，表明PCT免疫比濁法結果同樣可靠(n=67，R2=0.960 7)。

目前檢測PCT的方法很多[7]。傳統的放射免疫法敏感性較高，但檢測時間較長，且有放射性元素污染，使用受限；膠體金法為半定量法，不依賴儀器，操作簡便快速，但敏感性低，線性范圍小無法滿足臨床需求，只能作為臨床篩查；免疫發光法具有敏感度高、特異性強等特點，但是成本昂貴，不利于臨床推廣[8]。臨床需要一種快捷、準確、成本相對低廉的PCT測定方法，以便于臨床廣泛推廣應用。免疫比濁法簡便、快捷，適用于波長包括600 nm的各種生化分析儀，可滿足臨床急診及批量檢測的需要；而且成本較低，可以大大減低患者的檢測費用。

綜上所述，免疫比濁法檢測PCT的各項性能指標進行驗證和評價，均能滿足臨床檢測的要求，具有良好的發展前景。

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[5]莊俊華．臨床生化檢驗技術[M]．北京：人民衛生出版社，2009．

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.049

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